Диссертация (1174185), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Методика данногоисследованиябылапредварительноразработаналаборатории [53, 54, 342, 427, 530, 537].сотрудникаминашейПри этом использовалсяультразвуковой сканер SonoScape SSI-1000 (Китай) с линейным сосудистымдатчиком (частота 7,5 МГц) [53, 54, 342, 427, 530, 537]. В зависимости отналичия атеросклеротических бляшек и толщины интимо-медиального слоя всонных артериях (ТИМС СА) участников исследования им мог быть поставлендиагноз «атеросклероз». ТИМС СА измеряли с использованием программыProsound(R.Selzer, США) [53, 54, 342, 427, 530, 537]. Измеренияпроизводились в соответстветствии с критериями Манхейма и исследованияImprove [137, 561].Чтобыполучитьизображениесонныхартерийчеловека,приультрасонографии применяли ультразвук с частотой около 30 000 Гц.Ультразвуковой луч направлялся на артерию через специальный датчик, эхоотраженного звука использовалось для получения электронного изображениясонной артерии [53, 54, 342, 427, 530, 537].Алгоритмультразвуковогосканированияучастниковисследованиявключал сканирование [53, 54, 137, 342, 427, 530, 537, 561]:1) левой сонной артерии;2) наружной сонной артерии;3) синуса сонных артерий;4) правой сонной артерии;5) внутренней сонной артерии.103Для сканирования использовались три проекции сонных артерий:заднебоковая, боковая и переднебоковая [53, 54, 137, 342, 427, 530, 537, 561].При этом для фокусирования использовалась задняя стенка сосудов.
Среднееарифметическое измерений в трех проекцияхпринято было считатьпоказателем ТИМС участника исследования. Всю процедуру сканированиязаписывали в цифровом формате для последующего анализа с помощьюспециализированного программного пакета M’Ath 3.0 (IMT, Франция) [53, 54,137, 342, 427, 530, 537, 561]. Атеросклеротические бляшки (АСБ) оценивались,в зависимости от размера бляшки, согласно 4-бальной шкале [53, 54, 80, 81,122, 137, 342, 427, 530, 537, 561]:1) 0 баллов присваивалось в случае, если возвышенные атеросклеротическиепоражения в сонной артерии не были обнаружены;2) 1 балл присваивался в случае наличия стабильных атеросклеротическихбляшек и стеноза просвета сонной артерии до 20%;3) 2 балла присваивалось в случае наличия стабильных атеросклеротическихбляшек и стеноза просвета сонной артерии от 20 до 50%;4)3баллаприсваивалосьвслучаегемодинамическизначимыхатеросклеротических бляшек и стеноза просвета сонной артерии более 50%.На рисунке 3 представлен пример сканированного изображения,полученного при ультрасонографическом исследовании сонной артериичеловека [53, 54, 80, 81, 122, 137, 342, 427, 530, 537, 561].104Рисунок 3.
Пример сканированного изображения сонной артериичеловека, полученного при ультрасонографии, в целях определениятолщины интимо-медиального слоя, при использовании программы«ProSound» [53, 54, 80, 81, 122, 137, 342, 427, 530, 537, 561].2.3.3 Получение и подготовка образцов крови для анализаОбразцы крови (9 мл) брали из локтевой вены в пробирку объемом 10 мл,рано утром натощак. Антикоагулянтом служила Na2-ЭДТА.
Использовалсяматочный раствор 0,1 М Na2-ЭДТА в воде (pH 8,0). Соотношение свежей кровии Na2-ЭДТА составляло 9:1. В итоге конечная концентрация Na2-ЭДТАоказывалась равной 10 ммоль/л. Хранили образцы крови в морозильнике при200 C [89, 111, 114-116, 120.
494. 495, 501, 502, 504, 530].Отметим, что кроме молекулярно-генетического исследования, у пациентовбыл проведен биохимический анализ крови для измерения уровней сахара,общего холестерина, ЛНП, ЛВП и ТГ [53, 54, 342, 427, 530, 537].2.3.4 Выделение ДНКВыделение тотальной ДНК из образцов ткани аорты (10 мкг) или крови(5мл) проводилось методом фенол-хлороформной экстракции [89, 111, 114-116,120, 494, 495, 501, 502, 504, 530].К размороженной крови добавляли лизирующий буфер А в соотношении1:10 (соответственно) (состав буфера А: 0,32 М сахароза; 100% тритон Х-100;5мМ MgCl2; 0,01М трис-HCl, pH 7,6). Пробирки были объемом 50 мл.
В течение40 минут при +4оС проводили гемолиз крови. После этогопроводилосьцентрифугирование в течение 20 минут при 4 тыс. об/мин при охлаждении, притемпературе +4оС. Надосадочная жидкость сливалась. К преципитату добавлялибуфер В объемом 700 мкл (состав буфера B: 75 мМ NaCl; 25 мМ ЭДТА рН 8,0) иподвергалиресуспендированию.Полученную суспензию переносили в105пробирки объемом 1,5 мл. К ней была добавлена протеиназа К объемом 30 мкл(в концентрации 20 мкг/мкл). Пробы инкубировали при +56оС в течение 16-24часов [89, 111, 114-116, 120, 494, 495, 501, 502, 504, 530].Затем пробы были перенесены в пробирки на 2 мл с целью фенолхлороформной очистки.
В каждую пробирку был добавлен фенол объемом 900мкл и проведено центрифугирование при 13 400 об/мин в течение пятнадцатиминут. Верхняя водная фаза центрифугата, содержащая ДНК и межфазнуюпленку была перенесена в другие пробирки (2 мл), в которые затем былодобавлено 450 мкл фенола и 450 мкл хлороформа.
Полученные пробы быливновь центрифугированы при тех же условиях. Верхняя водная фазацентрифугата, содержащая ДНК и межфазную пленку была перенесена вдругие пробирки (2 мл), в которые затем был добавлен хлороформ объемом 900мкл. Полученные пробы были вновь центрифугированы при тех же условиях.После этого в новые 2 мл пробирки была перенесена только водная фаза,содержащая ДНК [89, 111, 114-116, 120, 494, 495, 501, 502, 504, 530].Осаждали ДНК изопропанолом объемом 900 мкл. Затем было проведеноцентрифугирование при 13 400 об/мин в течение пяти минут.
Аккуратно быласлита надосадочная жидкость. Пробы с ДНК подсушивали в течение пятиминут при 200C. Была проведена отмывка выделенных образцов ДНК отпримесей с помощью охлажденного этилового спирта (70%) объемом 900 мкл.После пятнадцатиминутной инкубации при комнатной температуребылопроведено центрифугирование проб при 13 400 об/мин в течение пяти минут.Надосадочную жидкость сливали. Преципитат, содержащий ДНК, был хорошовысушен на воздухе в течение 30 минут. Затем в него было добавлено 200 мклбуфера ТЕ (состав буфера ТЕ: 1мМ ЭДТА; 10мМ Трис-HCl, рН 8,0;).
Дляполного растворения ДНК в буфере ТЕ полученные пробы оставляли на 5 сутокпри температуре плюс четыре градуса Цельсия [89, 111, 114-116, 120, 494, 495,501, 502, 504, 530].КонцентрацияДНКвполученныхобразцахопределяласьнананоспектрофотометре IMPLEN NanoPhotometrTM (см. раздел 2.2.2.). Образцы106ДНК хранились при температуре минус двадцать градусов Цельсия [89, 111,114-116, 120, 494, 495, 501, 502, 504, 530].Рабочая концентрация ДНК в образцах для исследования мутаций игаплогрупп составляла 0,03 мкг/мкл [89, 111, 114-116, 120, 494, 495, 501, 502,504, 530].2.3.5 Электрофорез в агарозном геле амплификатов и образцов ДНКЭлектрофорез в агарозном геле амплификатов и образцов ДНК проводилина приборе фирмы «Хеликон» в горизонтальном агарозном геле.
Дляэлектрофореза использовался буфер ТBЕ (0,5Х). Была взята агароза фирмы«Fluka». Для анализа образцов ДНК был взят гель с концентрацией агарозы0,8%. В то же время для анализа ПЦР-фрагментов был взят гельсконцентрацией агарозы 1,5-2,0 % [96, 466]. Агарозный гель окрашивалираствором бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл. Красителем дляобразцов ДНК и амплификатов служил бромфеноловый синий. Его добавляли кобразцу в соотношении 1:10 [89, 111, 114-116, 120, 494, 495, 501, 502, 504,530].ДНК-маркеры 1 Kb (содержащий 13 фрагментов ДНК размером от 0.25 до10 Kb) и 100 bp (содержащий 10 фрагментов от 100 до 1000 п.н.) былииспользованы для того, чтобы идентифицировать молекулярный вес изучаемыхамплификатов (рисунки 4 и 5).
Данные маркеры выпускает фирма ЗАО«Сибэнзим», Россия [89, 111, 114-116, 120, 494, 495, 501, 502, 504, 530].Состав 10Х ТBЕ: борная кислота - 55 г; TrisHCl - 108 г; 0,5 М ЭДТА рН 8,0- 40 мл на 1000 мл буфера [89, 111, 114-116, 120, 494, 495, 501, 502, 504, 530].Примеры электрофорезов в агарозном геле амплификатов, содержащихисследованные митохондриальные мутации, продемонстрированы на рисунках6-13 [89, 111, 114-116, 120, 494, 495, 501, 502, 504, 530].107Рисунок 4. ДНК-маркер «1 Kb» (13 фрагментов от 0.25 до 10 т.п.н.).2.3.6 ПЦРДля исследованных мутаций митохондриального генома информация обусловиях для ПЦР и последовательностях использованных праймеров былавзята из литературных источников [89, 141, 158, 159, 179, 207, 252, 287, 294,297, 330, 341, 391, 402, 439, 530, 540, 551, 575, 594, 595, 601].Для измерения концентрации образцов ДНК (нг/мкл) использовалсянаноспектрофотометр IMPLEN NanoPhotometrTM с микрокюветой LabelGuardTM.Применялся режим «DSDNA» (при длине волны 260 нанометров) [89, 111, 114116, 120, 494, 495, 501, 502, 504, 530].Для ПЦР была взята ДНК в концентрации 0,1 мкг/мл и праймеры вконцентрации 10 пмоль/мкл [89, 111, 114-116, 120, 494, 495, 501, 502, 504, 530].108Рисунок 5.
ДНК-маркер «100 bp» (10 фрагментов от 100 до 1000 п.н.).109Рисунок 6. Гель/электрофорез ПЦР-фрагментов, содержащих областьмутаций 716T>G, m.750A>G, m.652delG, m.961insC и m.652insG [89]:1 и 7. ДНК-маркер «1 Kb» (13 фрагментов ДНК от 0.25 до 10 т.п.н.);2 и 8. ДНК-маркер «100 bp» (содержащий 10 ДНК фрагментов от 100до 1000 п.н.);3 и 9. Отрицательный контроль;4-6 и 10-12. Амплификаты с областью мутаций 716T>G, m.750A>G,m.652delG, m.961insC и m.652insG.Рисунок 7. Гель/электрофорез ПЦР-фрагментов, содержащих областьмутации m.1555A>G [89]:1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
