Диссертация (1174185), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Так как используется реверс-праймер,то анализируем insG. В случае 100% нормальных аллелей величина пика Gсоставляет 6 единиц, а в случае 100% аллелей со вставкой 7 единиц. Вкачестве контроля берем пик G, равный 4 ед. Затем процент гетероплазмии поданному типу мутаций также вычисляется согласно формуле №1:p = yx100% / 1, где «p» – процент гетероплазмии по мутации; однако, вэтом случае,«y» – разница между количеством единиц исследуемого инормального пика [89].При исследовании ДНК участка нормальной сосудистой ткани 43-летнегомужчины размер исследуемого пика G составил 26,53. В то же время величинаконтрольного пика равнялась 16,28.
Принимая во внимание, что 16,28 это 4единицы, размер исследуемого пика составил 6,52 единицы. Это на 0,52 ед.больше, чем высота пика при 100% нормальных аллелей [89].135Подсчитаем процент гетероплазмии по m.9537insC: 0,52x100% / 1=52%Процент гетероплазмии по m.9537insC равен 52 [89].IV типТочечные замены одной пары нуклеотидовСуществует два варианта гистограмм при данных мутациях. Взависимости от варианта существуют разные способы подсчета процентагетероплазмии [89].1 вариантПри этом варианте мы изучаем два пика нуклеотидов нормальныйи мутантный.
В этом случае мы не берем пиков для контроля, а определяем,сколько единиц составляет сумма двух пиков. Затем суммируем данные пообоим пикам; вычисляем, сколько единиц от суммы составляет мутантный пики на сколько единиц он больше (или меньше) нормы. После этогоподсчитываем процент гетероплазмии по формуле №1 [83, 87, 89, 94, 108, 111,112, 114, 123, 493, 495, 496, 532].Рассмотрим его на примере мутации m.3256C>T (т.к. используетсяреверс-праймер, то исследуется замена GA). При 100% митохондриальныхгеномов с нуклеотидом G в позиции 3256 0 ед. A и 1 ед. G (рисунок 20а); при100% геномов с нуклеотидом A в позиции 3256 – 0 ед. G и 1 ед.
A (рисунок20б). Мы принимаем сумму за 1 единицу, а затем подсчитываем процентгетероплазмии [83, 87, 89, 94, 108, 111, 112, 114, 123, 493, 495, 496, 532].Например, при анализе образца ДНК из сосудистой ткани 29-летнего мужчиныразмер пика A был равен 0,84; а размер пика G 3,05 (рисунок 20в). Суммапиков 3,89. Принимая во внимание, что 3,89 это 1 ед., то мутантный пик A136составляет 0,22 ед. Рассчитываем процент гетероплазмии по m.3256C>T:0,22x100% / 1=22% [83, 87, 89, 94, 108, 111, 112, 114, 123, 493, 495, 496, 532].а) Гомоплазмия по Gб) Гомоплазмия по A137Рисунок 20. Детекция мутации m.3256C>T (при использовании обратногопраймера для сиквенса GTAT). Анализируемый при пиросиквенсефрагмент TA/G [83, 87, 89, 94, 108, 111, 112, 114, 123, 493, 495, 496, 532]:а) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по отсутствиюзамены 3256 GA в митохондриальном геноме;б) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по наличиюзамены 3256 GA в митохондриальном геноме;в)практическаяпирограммаисследуемогообразцаДНК(уровеньгетероплазмии по мутации m.3256C>T составляет 22%).2 вариантПриданнойоднонуклеотиднойзаменеанализируемаяпоследовательность состоит не из двух, а из нескольких пиков нуклеотидов [89,105, 107, 497].
В таком случае подсчитываем общее количество единиц данныхпиков, суммируем данные по пикам для исследуемого образца ДНК, находим,какое количество единиц составляет пик мутантного нуклеотида от суммы и насколько единиц он отличается от нормы (т.е. от пика данного нуклеотида при100%нормальныхмолекулДНК),азатемподсчитываемпроцентгетероплазмии по данной мутации [89, 105, 107, 497].В качестве примера рассмотрим мутацию m.13513G>A. При 100%нормальных геномов с нуклеотидом G в позиции 13513 1 ед. A (пик №2), 1ед. G (пик №3), 1 ед. A (пик №4) (рисунок 21а); при 100% мутантных геномов снуклеотидом A в позиции 13513 3 ед. A, 0 ед.
G, 0 ед. A (рисунок 21б). Каквидно из гистограммы, процент гетероплазмии необходимо анализировать попику A (№2), т.к. именно в этой позиции происходит замена [89, 105, 107, 497].Суммируем данные по трем пикам, принимаем сумму за 3 единицы,после чего рассчитываем, сколько единиц составляет мутантный пик A (№2).Зная, на сколькоединицэтот пик больше пика, характерного для 100%нормальных аллелей, мы можем рассчитать процент гетероплазмии для данной138мутации по формуле №2: p = yx100%/2, где «p» – процент гетероплазмии помутации; «y» – разница между количеством единиц исследуемого инормального пика [89, 105, 107, 497].Например, при исследовании образца ДНК из сосудистой ткани43 – летнего мужчины, пик A (пик №2) составил 10,76; пик G (пик №3) – 4,64;пик A (пик №4) – 5,18 (рисунок 21в) [89, 105, 107, 497].а) гомоплазмия по G (100% нормальных геномов)20TAGAб) гомоплазмия по A (100% мутантных геномов)20TAGAв) гетероплазмия по A139Рисунок21.Детекциямутацииm.13513G>A.Анализируемыйприпиросиквенсе фрагмент AG/AA [89, 105, 107, 497]:а) теоретическая высота пиков нуклеотидов пригомоплазмии понормальному аллелю 13513G в митохондриальном геноме;б) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по мутантномуаллелю 13513A в митохондриальном геноме;в) практическая пирограмма исследуемого образца ДНКиз участкасосудистой стенки (гетероплазмия по мутации m.13513G>A составляет 30%).Сумма пиков – 20,58.
Принимая во внимание, что сумма равна 3 ед., размермутантного пика C составляет 1,6 ед., т.е. на 0,6 ед. больше нормы.Подсчитываем процент гетероплазмии: 0,6x100% /2=30%Таким образом, гетероплазмия по мутации m.13513G>A составляет 30%[89, 105, 107, 497].V типДва варианта точечной замены одной пары нуклеотидов в однойи той же позиции митохондриальной хромосомы человекаАнализ мутаций данного типа немного похож на анализ мутаций 2варианта IV типа.
Имеется три пика, размер которых меняется, в зависимостиот количества нормальных и мутантных хромосом. Для каждого вариантазамены характерна своя комбинация размеров пиков. Следует выяснить, накакое количество единиц изменяется размер мутантного пика при каждоймутации, и учитывать это значение при подсчете процента гетероплазмииотдельно для каждой из замен. Затем подсчитывается общее количество единицданных пиков, суммируются данные по пикам для анализируемого образцаДНК, определяется, какое количество единиц составляет пик мутантногонуклеотида от общей суммы, а затем считается процент гетероплазмии поданной мутации по формуле №1.
Если мы находим определенный процент140гетероплазмии по каждому варианту замены, мы говорим, что в даннойпозиции митохондриальной хромосомы человека есть гетероплазмия по обеиммутациям [89].Рассмотрим пример определения процента гетероплазмии для мутацииm.14482C>G/A. В одной и той же анализируемой области пирограммы можноопределить гетероплазмию по мутациям m.14482C>G и m.14482C>A.
При100% нормальных аллелей (C/C) пик C будет составлять 2 ед., пик G 0 ед.,пик A 1 ед. При 100% замене CG пик C будет равен 1 ед., G 1 ед., A 1ед. При 100% аллелей с нуклеотидом A в позиции 14482 пик C будет равен 1ед., пик G 0 ед., пик A 2 ед. Таким образом, при каждой из замен пикисследуемого нуклеотида увеличивается на 1 единицу.
Мы суммируем данныепо всем трем пикам, принимаем их равными 3 единицам и определяем, какоеколичество единиц составляет пик нуклеотида исследуемого варианта замены ина сколько единиц он больше нормы. Затем считаем процент гетероплазмии[89].Например, при анализе образца ДНК из сосудистой ткани 25-летнегомужчины размер пика C составил 12,52; пика G 0,45; пика A 12,41. Суммапиков оказалась равной 25,38. Поэтому, в единицах размер пика A равен 1,47;это на 0,47 единиц больше нормы.
В то же время, размер пика G равен0,05 единиц, что, соответственно, на такое же количество единиц большенормы. Теперь можно посчитать процент гетероплазмии для каждой из замен:а) для исследуемого пика A: 0,47x100% /1=47%;б) для исследуемого пика G: 0,05x100% /1=5% [89].Таким образом, гетероплазмия по мутации m.14482C>A в исследуемомобразце ДНК оказалась равной 47%, а по мутации m.14482C>G 5% [89].141VI типДве точечные замены, расположенные на соседних позицияхв митохондриальной ДНК человекаАнализ таких мутаций похож на анализ двух вариантов замен в одной итой же позиции хромосомы (мутаций V типа). В качестве примера приведеманализ мутаций m.8362T>G и m.8363G>A [89].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
