Диссертация (1154897), страница 6
Текст из файла (страница 6)
В этой связи в последнее времявнимание исследователей привлекает изучение радикалпродуцирующей функциинейтрофилов. Особенную актуальность этот аспект приобрел в связи с изучениемнетоза – формы клеточной смерти нейтрофилов. Среди заболеваний, гдепервичное повреждение нейтрофилов является ключевым патогенетическиммеханизмом АНЦА ассоциированные васкулиты занимают лидирующее место.Изучение радикал продуцирующей функции нейтрофилов у больных АНЦА –ассоциированными васкулитами в сравнении с заболеванием метаболическойприроды – сахарным диабетом позволит уточнить как патогенез васкулитов, так иобеспечить понимание места свободнорадикальных процессов в повреждениисосудистой стенки. Кроме этого возможно будут уточнены адаптивныемеханизмы при развитии окислительного стресса.ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯВ проспективное исследование были включены 40 больных с АНЦАассоциированными системными васкулитами.
Среди них было 30 мужчин и 10женьщин в возрасте 18–80 лет). Гранулематоз с полиангиитом (ГПА) был у 27,микроскопический полиангиит (МПА) у пяти, эозинофильный гранулематоз сполиангиитом (ЭГПА) у четырех человек. АНЦА положительными были 29больных, у остальных 11 АНЦА не определялись.
Все больные наблюдались вКлинике нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний имени Е.М.Тареева Первого МГМУ имени И.М. Сеченова с 2012 по 2015 гг. Диагнозыустанавливались согласно рекомендациям Конференции в Чапел-Хилле (2012).Критериями для включения в исследование были установленный диагнозАНЦА-ассоциированного васкулита и подписанное информированное согласие.Критериями исключения являлись: онкологические заболевания, алкогольнаяболезнь.30Группа сравнения состояла из двух подгрупп: первая группа былапредставлена 90 практически здоровыми донорами, во вторую группу вошли 50больных сахарным диабетом 2 типа, которые наблюдались в городскойполиклинике №2 города Москвы.Обследование больных проводилось по стандартам для больных васкулитамии включало в себя изучение анамнеза, физического обследования, лабораторные иинструментальные методы.Все больные были обследованы по традиционному плану.
Наряду с общиманализом крови, общим анализом мочи, биохимическими параметрами (общийбелок, альбумин, липидный обмен, глюкоза, гликированный гемоглобин,креатинин, мочевая кислота, фибриноген, С-реактивный белок), больнымваскулитами исследовались АНЦА – к протеиназе-3 (ПР-3) и миелопероксидазе(МПО) методом иммуноферментного анализа.Уровень АНЦА оценивался с помощью метода ИФА c верхней границейнормы 5 МЕ/мл.Активность васкулита оценивали с использованием индекса активностиBVAS (Birmingham Vasculitis Activity Score, version 3.0).
Для каждого пациентазаполняли форму BVAS [109, 110].Тяжесть необратимого поражения органов оценивали с помощью индексаVDI (Vasculitis Damage Index). Для каждого пациента заполняли форму VDI .При анализе течения болезни выделяли локальный (поражение верхнихдыхательных путей, органа зрения и слуха) и генерализованный (поражениеверхних дыхательных путей, органа зрения и слуха в сочетании с поражениемлегких и/или почек, а также желудочно-кишечного тракта, нервной системы,кожи) варианты.В зависимости от активности выделяли несколько фаз заболевания.Ремиссия — отсутствие признаков активности (общий счет 0-1 балл) принормальном содержании в крови СРБ на фоне стабильной поддерживающейтерапии.31Ответ на терапию (частичная ремиссия) — уменьшение на фоне леченияобщей суммы баллов на 50% от первоначальной.Низкая активность (персистирующая активность) - персистенция общихсимптомов воспаления (артралгии, миалгии и др.), которые купируютсянезначительным повышением дозы глюкокортикоидов (эскалации терапии нетребуется).Неактивная фаза — ремиссия, в период которой нет необходимости вподдерживающей терапии.«Большое» обострение — вовлечение в воспалительный процесс жизненноважных органов и систем (легких, почек, ЦНС, сердечно-сосудистой системы), иувеличение общей суммы баллов на 6 и более.«Малое»обострение—возобновлениесимптомовзаболеваниясувеличением общей суммы с 0–1 до 5 баллов; требуется повышение дозы ГКС до30 мг/сут.На момент исследования у 18 больных показатели АНЦА были выше нормыНа момент исследования окислительного статуса у большинства больныхсистемными васкулитами отмечались признаки активности разной степенивыраженности: с выраженной активностью — 9 больных (индекс BVAS 11-21), сумеренной активностью — 18 (индекс BVAS 3–10) и больные в ремиссии — 13(индекс BVAS 0–2).
Пациенты с генерализованной формой болезни — 31 чел, слокальной — 9 чел. Больные (35 человек) получали иммуносупрессивнуюиндукционную или поддерживающую ремиссию терапию; 5 больных не получалимедикаментозную терапию (впервые поступившие в стационар).Для оценки окислительного статуса использовались специальные методы.Определение антиоксидантной активности плазмы крови проводилосьметодом кинетической хемилюминесценции в модификации [111], основанной нарегистрации и обработке полной кривой развития ХЛ во времени.Оценку функциональной активности нейтрофильного звена лейкоцитовпроводилиметодомхемилюминесценции32сдвойнойпоследовательнойстимуляцией [112].С целью определения внеклеточного и внутриклеточного вклада продукциисвободныхрадикаловнейтрофиламипроводилиматематическийанализкинетической кривой хемилюминесценции с помощью программного модуля набазе платформы LabView (разработчик А.Ю.
Рябов)Деконволюциякривыхпозволяетразложитьитоговыйконтурнахл, *103 имп/сэкспоненциально-квадратичные составляющие: (рис. 1).1,2120,80,630,41ФМАфМЛФ0,20020406080100120Время, минРис.1.Экспериментальнаякриваяиэкспоненциально-квадратичныеконтуры, полученные в результате деконволюции, для крови здорового донора.а) ФМА-индуцированная продукция АФК (кривая 1)б) «быстрая» вспышка фМЛФ-индуцированной кривой, возможно, вызваннаяпродукцией АФК цитоплазматической НАДФН-оксидазой ( кривая 2)в) «медленная» вспышка, возможно, вызванная АФК НАФДН-оксидазыфаголизосом (кривая 3).Уровень окислительного стресса в крови по степени окисленностиальбумина измеряли методом флуоресценции [113].Статистическую обработку данных проводили, используя программный33пакет GraphPad Prisma 5.0. Результаты представлены в виде медианы иинтерквартальногоразмаха.Дляпроверкигипотезыонормальностираспределения данных использовали критерий Шапиро–Уилка (p > 0,05).
Дляизучения связи между данными использовали коэффициент ранговой корреляцииСпирмена. Коэффициент корреляции признавался достоверным при p < 0,05.Достоверность различия между группами определяли с помощью критерияМанна–Уитни. Различия признавали статистически достоверными при уровнезначимости p < 0,05.ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ3.1 Окислительный статус у больных ААВСогласно проведенному исследованию радикал продуцирующая способностьнейтрофилов не зависела от формы васкулита (ГПА, МПА, ЭГПА), что позволилов дальнейшем анализировать в целом всю группу (табл.1).Таблица 1Окислительный статус пациентов при: ГПА, МПА, ЭГПАПоказательГПАМПАЭГПАВыводыАнтиоксидантнаяСреднееСреднееСреднееРазличий нетактивность плазмы 326626441p = 0,07 (ГПА и МПА)(S(АОА)), ×103 импSr =141Sr =141p=0,73 (ГПА и ЭГПА)Sr = 36p = 0,21 (МПА и ЭГПА)Удельнаяпиковая Среднееактивностьнейтрофила6,4(А), Sr=5,3СреднееСреднееРазличий нет5,14,8p = 0,32 (ГПА и МПА)Sr =7,3Sr =0,9p= 0,95 (ГПА и ЭГПА)×10–2 имп/(с·кл)p = 0,51 (МПА и ЭГПА)УдельнаяСреднееСреднееСреднееРазличий нетинтегральная560850174971p = 0,21 (ГПА и МПА)активностьSr=4406Sr=3851Sr=1911p= 0,86 (ГПА и ЭГПА)34нейтрофилаp = 0,55 (МПА и ЭГПА)(S),имп/клКоэффициентСреднееСреднееСреднееРазличий нетзатухания0,310,350,43p = 0,82(ГПА и МПА)респираторногоSr =0,14Sr=0,25Sr=0,27p= 0,57 (ГПА и ЭГПА)взрыва (Kd)Доляp = 0,71 (МПА и ЭГПА)окисленного СреднееальбуминаСреднееСреднееРазличий нет0,500,450,41p = 0,54 (ГПА и МПА)Sr= 0,14Sr=0,14Sr =0,26p= 0,73 (ГПА и ЭГПА)p = 0,94 (МПА и ЭГПА)Sr – среднеквадратичное отклонениеОкислительный статус у больных ААВ (n = 40) при сравнении с практическиздоровыми донорами (n = 50) характеризовался значимыми нарушениями.
Так, посравнению с группой практически здоровых доноров, у больных отмечалисьповышения: антиоксидантной активности плазмы (p = 0,0001), удельной пиковойактивности нейтрофила (р = 0,01), удельной интегральной активности нейтрофила(р = 0,02), базальной радикал-продуцирующей активности (р = 0,006) и долиокисленного альбумина (p = 0,001). При этом, коэффициент затуханияреспираторного взрыва был значимо ниже (р = 0,01) (табл.2)Таблица 2Окислительный статус пациентов с ААВ и практически здоровыхдоноровПоказательГруппаГруппа ААВВыводыМедиана 358S(АОА) значимоконтроляАнтиоксидантнаяактивностьМедиана 219плазмы ИКР (192–259)ИКР(282– выше в группе(S(АОА)), ×103 имп438)ААВ, p = 0,0001УдельнаяМедиана 4,9А значимо вышепиковая Медиана 2,435активностьИКР (1,7–4,1)ИКР (2,5–7)в группе ААВ,нейтрофила (А), ×10–2р = 0,01имп/(с·кл)УдельнаяМедиана 2374интегральнаяИКРактивность3790)6442)р = 0,001КоэффициентМедиана 0,38Медиана 0,30KdзатуханияИКР (0,32–0,42)ИКРнейтрофилаМедиана 4148(1728- ИКРS значимо выше(3001- в группе ААВ,(S),имп/клреспираторного(0,18- ниже в группеААВ,0,46)взрыва (Kd)Базальнаязначимор = 0,01радикал- Медиана 0,27продуцирующаяИКР (0,17)Медиана 0,42AбззначимоИКР (0,22)выше в группеактивность (Aбз), ×10–2ААВ,имп/(с·кл)р = 0,006Доляокисленного Медиана 0,26альбумина (ДОА)ИКР (0,18-0,37)Медиана 0,49ИКРДОАзначимо(0,38- выше в группеААВ, p = 0,0010,59)ИКР – интерквартильный размахУ больных с генерализованной и локальной формами заболевания , различиймеждуантиоксидантнойифункциональной(радикал-продуцирующей)активностью выявлено не было.
Вместе с тем, было обнаружено значимоеразличиедолиокисленногоальбумина(ДОА)вгруппепациентовсгенерализированным течением болезни (среднее ДОА 0,56, Sr = 0,22) посравнению с группой с локальным течением болезни (среднее ДОА 0,47, Sr =0,20), p = 0,04), что указывает на степень выраженности окислительного стресса всвязи с генерализацией процесса. (табл.3)36Таблица 3ОкислительныйстатуспациентовсААВслокальнойигенерализованной формамиПоказательЛокальнаяГенерализованная ВыводыАнтиоксидантнаяСреднее 439Среднее 363Различийнет,активностьSr = 265Sr =225ноестьплазмы(S(АОА)),тенденция×103 импp = 0,07Удельнаяпиковая Среднее 9,3Среднее 5,1Различий нетSr=8,4Sr =3,3р = 0,31УдельнаяСреднее 7835Среднее 4659Различий нетинтегральнаяSr=6356Sr=3098р = 0,20КоэффициентСреднее 0,31Среднее 0,34Различий нетзатуханияSr =0,15Sr=0,17р = 0,78Среднее 0,56ДОАSr =0,15выше в группе сактивностьнейтрофила(А),×10–2 имп/(с·кл)активностьнейтрофила(S),имп/клреспираторноговзрыва (Kd)Доляокисленного Среднее 0,47альбумина (ДОА)Sr= 0,11значимогенерализовннойформой, p = 0,03Sr – среднеквадратичное отклонениеОднако, при сравнении групп больных ААВ с учетом индекса активностиBVAS, показатели антиоксидантной активности, функциональной активности37нейтрофилов и доли окисленного альбумина статистически значимо неразличались.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
