Диссертация (1154897), страница 13
Текст из файла (страница 13)
В качестве источника свободных радикалов в системеиспользовали диазосоединение - 2’-азо-бис(2амидинопропан) дигидрохлорид(АБАП; Fluka, США). В качестве хемилюминесцентного зонда использовалилюминол(5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-фталазиндион,аминофталевойкислоты,Хемилюминесцентный(C8H7N3O2;анализSigma-Aldrich,плазмыпроводилигидразидСША,на3-М=177,16).однокюветномхемилюминометре SmartLum 5773 (ДИСофт, Россия).В микропробирку объемом 1,5 мл помещали 50,0 мкл 50 мМ раствора АБАПи 20,0 мкл 0,1 мМ люминола. Смесь перемешивали в течение двух минут навстряхивателе «Vortex yellow line tts2» при частоте 1400 об/мин и инкубировали20 минут в темноте при комнатной температуре. Образование свободныхрадикалов в системе инициировали добавлением в кювету 930 мкл нагретого(37˚С) фосфатного буферного раствора (100мМ КН2РО4, рН 7,4; Sigma, США) к70,0 мкл смеси АБАП и люминола.
Помещали пробирку в кюветное отделениехемилюминометра. Регистрировали свечение до достижения стационарногоуровня (I0) при 37°С, затем добавляли 10 мкл плазмы крови, предварительноразбавленной в 10 раз. После добавления плазмы крови свечение прекращалосьблагодаря нейтрализации радикалов антиоксидантами плазмы крови, преждевсего, мочевой кислотой.
После расходования антиоксидантов свечение вновьнарастало и достигало нового стационарного уровня I (рис. П6), превышениекоторого над уровнем ХЛ до добавления плазмы служит показателемпрооксидантного действия белков крови. Общий объем пробы в кювете составлял1,000 мл.80IХЛ, усл.ед.I, В3,02,0I0, В1,0S, В*с0,0051015202530Время, минРис. П6. Типичная кривая развития хемилюминесценции при исследованииантиоксидантных свойств плазмы крови. Аналитические сигналы: S (В*с) –интегральная сумма (площадь над кривой), I0 (В) – исходный уровень образованиясвободных радикалов, задаваемый введением определенного количества АБАП, I(В) – уровень свечение, достигаемый после введения плазмы.Принципметодакинетическойхемилюминесценциизаключаетсяврегистрации и обработке полной кривой развития ХЛ во времени.
В качествеаналитических сигналов использовали: S – площадь над кривой, I/I0 –относительный прирост ХЛ. после добавления плазмы к системе.Оценка функциональной активности нейтрофильного звена лейкоцитовметодом люминол-активированной хемилюминесценцииПодход оценки функциональной активности нейтрофилов в цельной кровиоснованнарегистрацииразвитиявовременисвечениянейтрофилов,стимулированных последовательно двумя веществами с разным механизмомдействия(ОбразцовИ.В.,2015/2016).Напервомэтапенейтрофилыстимулировали форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА) с внутриклеточным81механизмом действия, на втором этапе проводили основную стимуляциюформил-метионил-лейцил-фенилаланином (фМЛФ), стимула с внеклеточныммеханизмом действия.
Двойная стимуляция приводит к максимально полномуответу нейтрофилов, следовательно, к улучшению чувствительности и точностиполучаемых результатов.В кювету, содержащую раствор Хенкса, стабилизированный HEPES (SigmaAldricg, США) и люминол в конечной концентрации 45 мкМ, помещали цельнуюкровь, отобранную в вакутейнеры с гепарином, в конечной концентрации 4,5%(45 мкл на 1,000 мл раствора в кювете) и регистрировали спонтанную ХЛ втечение 12 минут, затем вносили стимул ФМА (конечная концентрация в кювете50 нг/мл; Sigma-Aldricg, США). После 20 минут инкубации проводилистимуляцию фМЛФ (конечная концентрация 10 мкМ; Sigma-Aldricg, США) ирегистрировали индуцированный ХЛ ответ в течение не менее 60 мин (Рис.
П7).Рис.П7.ТипичнаякриваяразвитияХЛпридвойнойстимуляциинейтрофилов: (1) — спонтанная ХЛ, (2) — предстимуляция ФМА, (3) — основнаястимуляция фМЛФ. Стрелками обозначены моменты добавления стимулов.Анализ всей кинетической кривой позволяет значительно повыситьинформативность метода. Изучали аналитические показатели — среднюю82активность нейтрофила, коэффициент затухания (A2/A1) и Sфмлф, полученныеданные сравнивали с контрольной группой (практически здоровые доноры;Образцов И.В., 2015/2016).Дополнительныйметодматематическойобработкикривой–деконволюцияДля деконволюциикривых разработан программный модуль на базеплатформы LabView (разработчик А.Ю. Рябов), который позволяет разложитьитоговый контур для экспоненциально-квадратичные составляющие.В результате деконволюции каждая кривая может быть разложена на трисоставляющие:а) ФМА-индуцированная продукция АФК (красная кривая)б) быстрая вспышка фМЛФ-индуцированной кривой, возможно, вызваннаяпродукцией АФК цитоплазматической НАДФН-оксидазой (зеленая кривая)в) медленная вспышка, возможно, вызванная АФК НАФДН-оксидазыфаголизосом.Для каждой кривой считают время наступления максимума t1, t2, t3 исветосумму за 3000 секунд S1, S2, S3.Метод наглядно демонстрирует вклады различных источников продукцииАФК в нейтрофилах.Метод оценки уровня окислительного стресса в крови по степениокисленности альбумина, оцененная методом флуоресценцииСпектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре RF-5301PC(SHIMADZU, Япония) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1,00 см.Альбумин предварительно выделяли из плазмы.
Для этого к 100 мл плазмыкрови добавляли равное количество насыщенного раствора сульфата аммония((NH4)2SO4, Sigma-Aldrich, США). При этом глобулиновая фракция осаждалась, аальбуминовая оставалась в растворе. Полученную смесь перемешивали на83встряхивателе, образовавшийся осадок отделяли центрифугированием в течение10 минут при 450 g (микроцентрифуга MiniSpin — Eppendorf, Нидерланды).Использование сульфата аммония в качестве высаливателя на результатыспектрофлуориметрических исследований мешающего влияния не оказывалоВыделенный САЧ предварительно разбавляли в 500 раз в 100 мМ ФБ (рН7,4) и одновременно регистрировали спектр флуоресценции и спектр поглощения.Для расчета доли окисленного альбумина использовали формулу:ДОА =(I0 -I)I0,где I – флуоресценция выделенного из плазмы крови альбумина (335 нм), I0 –теоретическаяфлуоресценцияСАЧ,рассчитаннаясиспользованиемградуировочной зависимости Iфл (335 нм) = 0,6688·с (САЧ, мкг/мл).
СодержаниеСАЧ в кварцевых кюветах рассчитывали спектрофотометрически при 225 нм,использую градуировочную зависимость: А (225 нм) = 0,0063·c (САЧ, мкг/мл).84ПРИЛОЖЕНИЕ 28586.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
