Диссертация (1154825), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Модифицирована методика обследования женщинс ановуляторным бесплодием. Предложены практическому здравоохранениюрекомендации по обследованию и ведению пациенток с ановуляторнымбесплодием, представлены референсные значения уровня кисспептина у здоровыхженщин. Создана экспериментальная модель женского бесплодия, связанного сотсутствием овуляции (Патент на изобретение № 2571896 «Способ моделированияженского ановуляторного бесплодия на крысах»). Обоснована перспективностьдальнейших исследований в области применения кисспептина для науки ипрактики.Методологияиметодыисследования.Настоящееисследованиепроводилось в Экспериментальной лаборатории нормальной и патологическойфизиологии Медицинского университета «Реавиз», г.
Самара (зав. лабораториейд.м.н., профессор Зарубина Е.Г.); в Научно-исследовательской лаборатории попроблемам морфологии РЕАВИЗ, г. Самара, (зав. лабораторией д.м.н., профессор,академик РАМТН Марков И.И.); ООО «Независимая лаборатория ИНВИТРО»,г. Самара (зав. лабораторией — канд. биохим. наук Желтякова О.В.).Для реализации поставленных задач диссертационное исследованиепроводили в два этапа: экспериментальный и клинический.На первом этапе исследования основным стал метод модельногоэксперимента.
1 этап — экспериментальное изучение роли кисспептина врегуляции эстрального цикла крыс — состоял из 3 частей.Эстральный цикл у самок млекопитающих — это совокупность регулярно8повторяющихсяизмененийфункционированиемполовой системы, связанныхяичников,чтоопределяетсциклическимгормональнуюрегуляциюсинхронных изменений во всём организме самки и особенно в ее половом аппарате(яйцеводы, матка и влагалище) [108, 193].Для синхронизации эстральных циклов первоначально были взяты 60 крыс,которых содержали в стандартных условиях в течение 1 месяца.
Регулярно у нихоценивали фазы цикла путем анализа цитологической картины влагалищныхмазков, измерения базальной температуры. Из этого количества лабораторныхживотных для проведения запланированной экспериментальной работы былиотобраны 36 половозрелых молодых самок крыс линии Wistar в возрасте 6 месяцев,весом 195,0±10,0 г, у которых синхронизировались эстральные циклы.Продолжительность синхронизированных эстральных циклов у отобранных крыссоставляла в среднем 4,9±0,2 сут.
Все отобранные животные были разделены намина 2 группы (опыт и контроль).В дальнейшем отобранные для эксперимента животные находились вусловияхстандартногорежимаосвещенияпритемпературе20-22°С.Люминесцентные лампы (освещенность 750 лк на уровне клеток) освещалипомещение в течение 12 дневных часов, на ночь (12 ч) свет отключали. Кормлениекрыс производили полнорационным гранулированным кормом при свободномдоступе к воде. Эксперимент проводили с учётом Правил лабораторной практикив РФ и директив Европейской Конвенции по защите позвоночных животных [66].В первой части эксперимента изучали ритмичность функционированияяичников животных. Оценку фаз эстрального цикла крыс проводили на основецитологического изучения влагалищных мазков.
Методика основана на том, чтокаждой стадии полового цикла самок млекопитающих соответствует определеннаяклеточная картина влагалищных выделений. Забор материала осуществлялсяежедневно на протяжении 4-х недель с помощью марлевого тампона. Мазкианализировали при увеличении 10х20 после окраски 0,5% спиртовым растворомметиленового синего.Во второй части экспериментального этапа работы все животные были9разделены на 2 подгруппы по 18 (контроль) и 18 (опыт) особей ссинхронизированными эстральными циклами. С целью изучения влияния наэстральный цикл крыс блокады кисспептинергических рецепторов животным изопытной группы вводили блокатор кисспептинергических рецепторов —kisspeptin-234 trifluoroacetate salt (Sigma, USA), 10 мкл раствора (2х10-3 моль).
Длячистоты эксперимента в контрольной группе вводили такой же объем 0,9%раствора NaCl (10 мкл). Вещества вводили в носовые ходы однократно в указаннойфармакологической дозе. Результаты оценивали по изменениям базальнойтемпературы и влагалищных мазков на протяжении не менее 10 суток.В третьей части эксперимента изучали стимулирующее влияние кисспептинана «заблокированный» эстральный цикл крыс, для чего на фоне пролонгированногов 2 раза диэструса животным из опытной подгруппы вводили 10 мкл раствораkisspeptin-234 (2х10-2 моль), а контрольным животным аналогичный объем 0,9%раствора NaCl.
Результаты оценивали, как и ранее, по изменениям базальнойтемпературы и влагалищных мазков на протяжении 4 дней ежедневно (методСтоккарда и Папаниколау) на микроскопе «XS-910» (ОМО, Россия, 2011) приувеличении10х20,оснащенномцифровойнасадкойдлякомпьютернойвизуализации изображения DCM130 (Shangrao TeleView Optical Instruments,Китайская Народная Республика, 2011).
Увеличение фазы диэструса с 2 суток до 5дней расценивали как «экспериментальное нарушение эстрального цикла» —отсутствие овуляции.Оценку фаз эстрального цикла крыс проводили на основе цитологическогоизучения влагалищных мазков (метод Стоккарда и Папаниколау) [28]. Методикаоснована на том, что каждой стадии полового цикла самок млекопитающихсоответствуетопределеннаяклеточнаякартинавлагалищныхвыделений(Рисунок 1).Материал для цитологического исследования получали путем осторожногоприкосновения ватно-марлевым тампоном к боковой стенке влагалища (несоскабливая слизистую оболочку): в мазок попадали только те клетки, которыесвободно отделялись от слизистой оболочки влагалища. Взятый материал10переносили на предметное стекло, фиксировали и окрашивали 0,5% спиртовымраствором метиленового синего.
Для определения фазы эстрального цикла послеокрашивания мазки анализировали при увеличении 10х20 на микроскопе «XS-910»(ОМО,РФ,2011),оснащенномцифровойнасадкойдлякомпьютернойвизуализации изображения DCM130 (Shangrao TeleView Optical Instruments,Китайская Народная Республика, 2011).Рисунок 1 — Эпителиальные слои влагалища: 1, 2 — поверхностные клетки;3, 4 — промежуточные клетки; 5 — парабазальная клетка; 6 — базальные клеткиПодсчет клеток включал изучение не менее 8–10 полей зрения (200–300клеток, преимущественно из центра мазка).
При цитологической оценкевлагалищных мазков крыс применяли упрощенную классификацию Geist, Salmonи определяли 2 показателя (индекса) [51].1. Индекс созревания (ИС, «Числовой индекс») — рассчитывается какотношение трех видов эпителиальных клеток (выраженное в процентах) —парабазальных, промежуточных и поверхностных и записывается в виде чиселслева направо.
Интерпретация полученных числовых параметров: появлениепарабазальных клеток (сдвиг влево) означает, что функция яичников недостаточна,«увеличение количества поверхностных клеток (сдвиг вправо) свидетельствует овысокой эстрогенной насыщенности организма» [51].112.Кариопикнотическийиндекс(КИ)—процентноеотношениеповерхностных клеток с пикнотичными ядрами к общему числу клеток в мазке.Чем больше значение этого индекса, тем выше эстрогенная насыщенностьорганизма.Измерение базальной температуры у крыс проводили с помощьюмедицинского термометра (термометр электронный Omron Flex Temp Smart, OmronHealthcare, Япония).Для исследования влияния кисспептина на эстральный цикл крыс применялиблокатор кисспептинергических рецепторов – kisspeptin-234 trifluoroacetate salt(Sigma, США, для крыс) и кисспептин (Sigma, США, для крыс).На втором этапе работы для решения поставленных задач былииспользованы общеклинические и специальные методы исследования с цельюизучения уровня кисспептина и его корреляционных связей с уровнемгипофизарных гормонов: ФСГ, ЛГ, пролактина; уровнем стероидных гормонов(прогестерона, эстрадиола), а также его влияния на репродуктивную системуженщин.Всего в исследование было включено 237 женщин.
Все пациентки былиразделены нами на 4 клинические группы. При распределении женщин по группамучитывали критерии здоровья, регламентированные приказом МинистерстваЗдравоохранения РФ №572н от 01.11.2012 с поправками от 11.06.2012 (часть VII).При обследовании беременных и пациенток, страдающих бесплодием, соблюдалиперечень обследования, указанный в приложениях 5 и 20 приказа 572н от01.11.2012 («Группы здоровья», «Группы диспансерного наблюдения», «Базовыйспектр обследования беременных женщин», «Базовый спектр обследованиягинекологических больных в амбулаторных условиях») [23, 24].I группу составили 82 женщины, не планировавшие и не имевшиебеременностей, живущие регулярной половой жизнью и использовавшиемеханическую контрацепцию (презерватив).II группа — 85 женщин, ранее не страдавших бесплодием, имевших ванамнезе закончившиеся нормальными родами 1–2 беременности, в настоящее12время не планировавших беременность, живущих регулярной половой жизнью ииспользующихсцельюпредохранениямеханическуюконтрацепцию(презерватив).III группа — 37 здоровых беременных, имевших в анамнезе 1–2беременности, включая настоящую.IV группу составили 33 женщины, страдавшие первичным и/или вторичнымановуляторным бесплодием в течение 5 лет и более.
Первоначально в группуисследуемых женщин вошло 1258 пациенток с бесплодием неясного генеза. 1058из них выбыли с учетом критериев исключения, 35 выбыли в связи с переездом,248 — в связи с диагностированным мужским бесплодием, 159 — по собственномужеланию и т.п. Осталось 33 женщины с ановуляторным бесплодием.Пациенты IV группы (т.е. 1258 чел.) в полном объеме были обследованысогласно приказу МЗ РФ № 107н от 30.08.2012 г. [24]. Пациенток обследовали неранее чем через 1–2 месяца после отмены гормональных препаратов.В исследование включали женщин в возрасте от 18 до 35 лет, ввидуфизиологической незрелости пациенток моложе 18 лет, а также существенновозрастающего у пациенток 35 лет и старше влияния экзогенных факторов,которые могут повлиять на полученные результаты.
К их числу можно отнестивоспалительные процессы половых органов, миому, эндометриоз, аборты,профессиональныефакторы,стрессы,многочисленныеэкстрагенитальныезаболевания и т.п. У всех пациенток получено согласие в письменной форме навыполнение исследования.Критериями исключения служили:• пороки развития мочеполовой системы;• острые и обострение хронических специфических и неспецифическихвоспалительных заболеваний женских половых органов на момент обследования;• болезни эндокринной системы, нарушения питания и обмена веществ;• сниженный овариальный резерв;• онкологические заболевания, в том числе в анамнезе;• аутоиммунные, неврологические, психические заболевания;13• соматические заболевания тяжелой и средней степени тяжести, а такжелюбые заболевания в стадии обострения;• наличие зарегистрированных профессиональных вредностей, хроническихстрессов, тяжелого физического труда, в том числе труда в экстремальных дляорганизма условиях;• нерегулярная половая жизнь;• изменения в спермограмме супруга.При сборе анамнеза оценивали возраст, репродуктивное здоровье (менархе,регулярность менструального цикла, контрацепция, возраст начала половой жизни,реализация репродуктивной функции: роды, искусственные аборты, выкидыши,бесплодие;использованиевспомогательныхрепродуктивныхтехнологий;гинекологические заболевания в анамнезе: воспалительные заболевания органовмалого таза; оперативные вмешательства на органах малого таза — матке ипридатках матки), экстрагенитальные заболевания: сердечно-сосудистой системы,органов дыхания, желудочно-кишечного тракта, крови, мочевыделительной,нервной, эндокринной, костно-мышечной систем.В социально-экономической части работы проведен анализ социальногостатусапациентов—семейноеположение(бракзарегистрирован,незарегистрирован), условия работы, профессиональные вредности.Для определения воздействия алкоголя на организм женщин намииспользованы нормы потребления алкоголя, разработанные ВОЗ, по которым дозыалкоголя разбиты на 3 группы по уровню риска развития отрицательныхпоследствий, который представляет для организма соответствующая доза.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
