Диссертация (1154341), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Определяли состояниенаружного зева и придатков матки.Всем пациенткам была проведена простая и расширенная кольпоскопия накольпоскопеCarlZeissSurgicalGmbH150-FC(ФРГ),споследующимцитологическим исследованием.Ультразвуковое исследование (УЗИ) органов малого таза проводили всемпациенткам на аппарате «Aloka» (Япония) с использованием трансвагинальногодатчика 7,5 МГц.
Эхографические изображения записывали на жесткий дискприбора в виде цифровых изображений в двухмерном режиме, фотографий ивидеофайлов. Данные обрабатывали при помощи компьютерной программыархивирования и обработки ультразвуковых данных. В ходе эхографическогоисследования определяли положение матки, характер контура, внутреннююструктуру, затем измеряли размеры матки, толщину и эхоструктуру миометрия.Объем матки определяли по формуле для измерения объема овоидных предметовпо J. Brunn (1981) [117]:объем матки=(D1м×D2м×D3м)×0,457,где длина матки – D1м, ширина – D2м и переднезадний размер – D3м.Особое внимание обращали на состояние эндометрия — срединное маточноеэхо (М-эхо), оценивали его эхогенность, структуру, измеряли величинупереднезаднего размера. При исследовании яичников, помимо их размеров,оценивали на толщину капсулы, количество фолликулов. Исследование выполненона базе консультативно-диагностического отделения ГБУЗ «ГКБ имени В.М.Буянова Департамента здравоохранения города Москвы» (зав.
отделениемультразвуковой диагностики — к.м.н. Савицкая О.В.).Дляуточнениясостоянияполостиматки,диагностикисостояниявнутриматочных структур осуществляли жидкостную гистероскопию подкратковременным внутривенным наркозом (калипсол, деприван, пропофол).При выполнении исследования использовали жесткие гистероскопы типа Hamou I(30°) и Hopkins II (30°) (Karl Storz GmbH & С0, ФРГ) с наружным диаметром 5 мм.18В качестве среды растяжения полости матки использовали стерильныйизотонический раствор натрия хлорида. Для инстилляции жидкости с цельюрегуляции скорости потока и давления использовали аппарат HAMEUOENDOMAT, «Karl Storz».
Во время гистероскопии оценивали размеры и формуполости матки, наличие деформаций. Особое внимание обращали на состояниеэндометрия: цвет, толщину, складчатость, наличие полиповидных образований,внутриматочных синехий, эндометриоидных ходов. Под гистероскопическимконтролем проводили раздельное диагностическое выскабливание стенок полостиматкиицервикальногоканала.Полученныйматериалотправлялинаморфологическое исследование.Гистологическому исследованию подвергали операционный материал послераздельного диагностического выскабливания стенок полости матки.
Проводкуматериала и приготовление парафиновых блоков осуществляли по стандартнойсхеме. Из полученных парафиновых блоков приготовляли срезы толщиной 4-5микрон. Срезы фиксировали на предметные стекла и в течение 12 часовинкубировали в термостате при 37°С. Гистологические срезы окрашивалигематоксилин-эозином. При осмотре гистологических препаратов устанавливалихарактер патологического процесса в эндометрии и степень выраженностигиперплазии эндометрия, руководствуясь гистологической классификацией ВОЗ.Исследования проводили на базе патологоанатомического отделения федеральногонаучно-клинического центра специализированных видов медицинской помощи имедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства (зав.отделением – д.м.н., профессор Забозлаев Ф.Г.).Сцельюоценкисывороточнойиммунореактивности,отражающейколичество и аффинность некоторых видов естественных эмбриотропныхаутоантител, взаимодействующих с белками–регуляторами эмбриогенеза нами былприменен метод «ЭЛИ-П-Тест» (ELISA-detected Probably of pathology), основанныйна стандартном иммуноферментном анализе.Определяли антитела к следующим антигенам:1.
ОБМ (антиген-1) – основному белку миелина, участвующему в регуляции19созревания нервных волокон и гемопоэтических клеток;2. S100 (антиген-2) – белку, участвующему в регуляции миграциинейробластов спинного и головного мозга и их функциональной дифференцировке;3. АСВР-14/18 (антиген-3) – кислому белку, прочно связанному схроматином, участвующему в регуляции экспрессии генов;4. МР-65 (антиген-4) – мембранному белку, относящемуся к суперсемействуинтегринов, участвующему в регуляции межклеточной адгезии.Вработеиспользовалидиагностическиенаборы«ЭЛИП-П-Тест».Постановку реакций проводили согласно инструкции к наборам, утвержденной МЗРФ (1999) в лаборатории молекулярной медицины Медико-экологического фонда«Чернобыль-Тест».Принцип работы набора состоит в следующем.
В лунках планшета, наповерхности которых сорбированы антигены 1, 2, 3 и 4, после добавленияразведенных контрольной сыворотки и анализируемых проб сыворотки крови и ихинкубации устанавливается равновесие между связанными и свободнымиантителами к соответствующим антигенам. После удаления содержимого лунок ивнесения в них раствора конъюгата кроличьих антител к IgG человека спероксидазой хрена на связанных антителах происходит сорбция молекулконъюгата в количестве, прямо пропорциональном количеству связавшихсяантител.Послеудаленияизбытканесвязанногоконъюгатапроводитсяферментативная реакция для определения активности пероксидазы, входящей всостав конъюгата.
Оценка проводится фотометрически при длине волны 492 нм,после чего рассчитывается относительная иммунореактивность определяемыхантител в пробах, выраженная в процентах от иммунореактивности контрольнойсыворотки.В работе использовали следующие оценочные критерии:–нормореактивность–еслиинтенсивностьреакцииисследуемойсыворотки с любым из изучаемых белков-антигенов составлявила 5-40% отинтенсивности реакции сыворотки-эталона;–гиперреактивность–еслиинтенсивностьреакцииисследуемой20сыворотки с любым из белков составила 41% и более от интенсивности реакциисыворотки-эталона;–гипореактивность – если интенсивность реакции исследуемой сывороткис любым из изучаемых белков оказывалась ниже значений нормы реакции.В зависимости от степени отклонений уровня эмбриотропных антител всехпациенток подразделяли на следующие классификационные группы:–К (группа нормы) - уровень эмбриотропных аутоантител от –15% до+40%;–К2 (группа слабых отклонений) – уровень ЭаА в пределах от –25% до+65%;–К3 (группа умеренных отклонений) – от –45% до +100%;–К4 (выраженные отклонения) – от –65% до+150%;–К5 (очень сильные отклонения);–К6 (эксквизитные отклонения).Исследование было выполнено на базе иммунологического отделениялаборатории ЗАО «ПИННИ» г.
Москвы (директор лаборатории — Третьяков В.Е.).В ходе анализа аллельного полиморфизма генов системы детоксикации (генасемейства цитохромов CYPIАI, гена семейства глутатион –S- трансфераз - GSTPI)и гена межклеточных взаимодействий – GPIIIa было выполнено исследованиебиообразцов ДНК.Для получения ДНК-матрицы из периферической крови 200 мкл крови(непосредственно при взятии у больного) добавляли в пробирку, содержащую50 мкл 50 мМ раствора Na-ЭДТА (рН 8,0).
В таком виде кровь хранили 35–45 сутокв бытовом морозильнике (около -12° С).В микропробирку к 250 мкл смеси крови и раствора Na-ЭДТА (рН 8,0)добавляли 6 мл гемолитика, перемешивали 5-6 раз, оставляли на 20 мин прикомнатной температуре. Полученную смесь центрифугировали 11 мин на3000 об/мин при комнатной температуре. Супернатант отбрасывали. Принедостаточном лизисе эритроцитов (осадок коричневый) добавляли к осадку ещераз 4 мл гемолитика, перемешивали и выдерживали еще 20 мин при комнатной21температуре.Полученнуюсмесьцентрифугировали10-11минпри3000 тыс. об/мин. при комнатной температуре.
Супернатант отбрасывали. Держалипробирки в вортексе 15 с, чтобы осадок соскочил и разбился. Добавляли 2 мл NucleiLysis и еще раз перемешивали на вортексе, чтобы осадок разошелся. Переставлялипробирки в термостат на 30 мин при 37С. После термостатирования в пробиркахоставался прозрачный раствор, который охлаждали несколько минут вхолодильнике.
Далее добавляли 700 мл Protein Precipitation, энергично встряхивали15-20 до образования мутной взвеси. Немедленно центрифугировали 11 мин при3000 об/мин и комнатной температуре. Надфильтрат сразу переливали в новыепробирки. По стенке пробирки осторожно добавляли 2 мл изопропанола, чтобыполучилосьдвефракции.Далееперемешивалижидкости,осторожнопереворачивая пробирку 5-6 раз до образования белой сеточки ДНК.Полученный субстрат центрифугировали 4 мин при 3000 об/мин прикомнатной температуре. Осторожно сливали изопропанол, к осадку добавляли 2 мл70% этилового спирта.
Осторожно перемешивали, два раза перевернув пробирку.Полученную смесь центрифугировали 4 мин при 3000 об/мин, по окончании сразуже сливая этиловый спирт. Пробирки оставляли сушиться открытыми прикомнатной температуре в течение 10-14 ч. Разводили в 0,5 мл ТЕ (х1) иинкубировали 1,5–2 ч при 65С в термостате. Хранили в замороженном виде притемпературе -20С, для использования разводили в 10 раз.ПЦР проводили с использованием многоконального амплификатора ДНКМС-2 “Терцик” (Россия). Для усиления специфичности ПЦР использовалиспециальный режим с внутренними праймерами – NESTED ПЦР.Амплификацию осуществляли в 25 мкл реакционной смеси, содержащей66 мМ Tris-HCl pH 8,8; 16,6 mM (NH4)2SO4; 2,5 mM MgCl2; 0,1 мг/мл желатина, 250мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, по 10 пмоль каждого праймера и 2 ед.Taq-полимеразы ("Promega" США) при следующем температурном профиле:денатурация 940С – 30 с, отжиг 58С – 10 с, синтез 720С – 20 с в течение 35 циклов.Дефосфорилирование 5’-концевых фосфатных групп dNTP в прошедшейамплификацию реакционной смеси проводили в ходе инкубации с 0,5 ЕД щелочной22фосфатазы арктических креветок (Shrimp Alkaline Phosphatase (Fermentas, Литва) втечение 20 мин при 37 С и последующей инактивации фермента прогреванием втечении 10 мин при 85С.Для идентификации точечных однонуклеотидных замен в гене использовалиолигонуклеотидныезондыиподходящиесмесидезокси-идидезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP и ddNTP).
Реакцию термоциклическогоминисеквенирования проводили в 10 мкл реакционной смеси: 66 мМ Tris-HCl pH9.0; 16.6 мМ (NH4)2SO4; 2.5 мМ MgCl2; по 20 пмоль каждого зонда, по 2 наномольсмеси дезокси- и дидезоксинуклеотида и 2 единицы TermiPol DNA Polymerase(Solis Biodyne, Эстония), используя в качестве матрицы амплифицированныйфрагмент соответствующих генов. Наработку продуктов минисеквенированияосуществляли по профилю: 94 С – 20 с, 58 С – 20 с, 72 С – 15 с, 70 циклов.Очистку продуктов реакции минисеквенирования и секвенированияпроводили с помощью SpectroCLEAN Kit (Sequenom, США) согласно инструкциифирмы-производителя.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
