Диссертация (1154341), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Входящий в состав набора сорбент в количестве 8 мграстворяли в 15 мкл ультрачистой воды (Merck, Германия), после чего полученнуюсуспензию вносили в пробирку с продуктами реакции минисеквенирования.Содержимое пробирки тщательно перемешивали и инкубировали при комнатнойтемпературе 15 мин. Сорбент осаждали центрифугированием в течение 5 мин при1000 об/мин.
Супернатант использовали для масс-спектрометрического анализа.Исследование выполняли на базе иммунологического отделения лаборатории ЗАО«ПИННИ» г. Москвы (директор лаборатории — Третьяков В.Е.).Активность лизосомальных ферментов N–ацетил--D-глюкозаминидазы(АСЕ) и -D глюкуронидазы (GLU) определяли в плазме крови, а также в тканиэндометрия.Забор материала.
2 мл крови отбирали из локтевой вены пациентки впробиркус0,22млрастворацитратанатрия(всоотношении9:1),центрифугировали в течение 5 мин при 2500 об/мин и получали плазму крови дляопределения активности GLU и АCE.Гомогенизация и фракционирование тканей. Ткань эндометрия отмывали23при 0–4°С, промокали фильтровальной бумагой, взвешивали.
Навеска — 0,5 г.Полученные образцы измельчали ножницами и гомогенизировали в стеклянномгомогенизаторе Поттера–Эвелгейма с тефлоновым пестиком (зазор — 0,21 мм) втечение 180 с при 40 об/мин. Гомогенат готовили из расчета 1:10 (масса ткани кобъему гомогенизационного буфера) и подвергали центрифугированию наультрацентрифуге 18-80 М фирмы Beckman (США).В результате второго центрифугирования получали лизосомный супернатант(надосадочную жидкость) и обогащенную лизосомами фракцию (осадок), которуюресуспендировали в соотношении 1:5 в буферном растворе 0,7 М сахароза (х.ч.),1 мМ ЭДТА ("Серва", ФРГ), рН 7,0.
О структурной целостности лизосом судили поуровню активности лизосомных ферментов в различных фракциях.Изучаемые виды активности лизосомных ферментов:А. Свободная, или неседиментируемая, активность (НСА) — активностьферментов, выделившихся в цитозоль, определяемая в супернатанте.Б. Доступная активность (ДА) — активность ферментов, определяемая вобогащенном лизосомами осадке и доступная для субстрата.В.
Общая активность (ОА) — определялась после разрушения лизосомныхмембран методом замораживания–оттаивания обогащенного лизосомами осадка.Исходя из полученных величин активности лизосомных ферментов,рассчитывали следующие показатели:1.Связанная активность (СВА) — разница между общей и доступнойактивностями обогащенного лизосомами осадка:СВА = ОА–ДА;2.Латентность (Л) — разница между общей и доступной активностямиотносительно общей активности (%):Л=3.ОА − ДАх 100%ОАКоэффициент лабилизации лизосомных мембран (КЛЛМ) — долядоступной активности фермента относительно общей (%):КЛЛМ =ДАх 100%ОА244.Коэффициент проницаемости лизосомных мембран (КПЛМ) — долянеседиментируемой активности фермента относительно общей (%):КПЛМ =АктивностьНСАх 100%ОА-D-глюкуронидазы(К.Ф.3.2.1.31.)иN-ацетил--D-глюкозаминидазы (К.Ф.3.2.1.53.) определяли в плазме крови и во всех фракциях,выделенных из ткани эндометрия.1.
Активность-D-глюкуронидазыопределяликолориметрическипоскорости освобождения фенолфталеина из субстрата фенолфталеин-глюкуронида.2. АктивностьN-ацетил--D-глюкозаминидазыопределяликолориметрически по скорости освобождения 4-нитрофенола и субстрата 4нитрофенил-М-ацетил--D- глюкозаминид.Для этого использовали инкубационную смесь: 2 мМ фенолфталеинглюкуронид и 5 мМ 4-нитрофенил-N-ацетил--D-глюкозаминид в 0,2 М ацетатномбуфере, рН 5,5.
При определении ДА в осадочной фракции, обогащеннойлизосомамидлядополнительнойстабилизациилизосомныхмембран,винкубационную смесь вводили 0,7 М сахарозы.К 100 мкл инкубационной смеси добавляли 20 мкл исследуемого материала(для определения ОА и ДА фракции тканей разводят в соотношении 1:5).Инкубация при 37С для материалов из плазмы и тканей 20 мин. Реакциюостанавливали 0,5 мл холодного раствора 1M Na2СО3.Фотоколориметрировали в микрокюветах на спектрофотометре СФ-2000(Cанкт-Петербург) при длине волны 405 нм (N-ацетил--D-глюкозаминидаза) и 555нм (-D-глюкуронидаза). В контрольном опыте исследуемый материал добавлялипослеостановкиреакции.Опытныйиконтрольныйобразцыспектрофотометрировали против компенсационного раствора, содержащего 20 мклсоответствующего гомогенизационного буфера, 100 мкл 0,2 М ацетатного буфера,рН 5,5, 0,7 М сахароза и 0,5 мл М Na2СО3.Коэффициенты молярной экстинкции 4-нитрофенол и фенолфталеинаопределяли по стандартным кривым, построенным при фотометрировании25стандартных растворов 4-нитрофенола ("Реахим") и фенолфталеина ("Реахим") в 1М Na2СО3.Активность ферментов выражали в нмоль освобожденного за 1 мин изсубстрата 4-нитрофенола или фенолфталеина на 1 мг белка в исследуемомматериале.
Количество белка в пробе определяли по методу Lowry в модификацииС.П. Сяткина.Исследованиевыполненонабазеиммунологическогоотделениялаборатории ЗАО «ПИННИ» г. Москвы (директор лаборатории — Третьяков В.Е.).Иммуногистохимическиеметодыисследованиявключалииммуногистохимический анализ содержания эстрогеновых (ER), прогестероновых(PR) рецепторов в ткани эндометрия. В качестве первичных антител использовалимоноклональные кроличьи антитела против anti-Progesterone Receptor (1E2); antiEstrogen Receptor (SP1) (Ventana); моноклональные кроличьи антитела против antiandrogenReceptor(SP107)производстваSpringBiocience.Оценкуиммуногистохимической реакции оценивали полуколичественным методом,используя стандартный подход — подсчет числа клеток, экспрессирующих маркерна 100 клеток в 10 полях зрения.Результаты иммуногистохимической реакции оценивали в баллах по шкалеAllred (сумма баллов количества иммуноокрашенных клеток и интенсивностиокрашивания).
Для этого количество ИГХ-позитивных клеток оценивали в баллахследующим образом: 0=0% клеток, 1=0,1–1% клеток, 2=2–10% клеток, 3=11–33%клеток, 4=34–66% клеток, 5=67–100% клеток, а интенсивность окрашиванияоценивали в баллах следующим образом: 0 – полное отсутствие продукта реакцииили выявление его в цитоплазме и ядрах менее 5% (экспрессия отсутствует), 1 –выявление продукта реакции в цитоплазме и ядре от 5 до 40%, распределенногофокально или диффузно (экспрессия слабая), 2 – выявление продукта реакции вцитоплазме и ядре от 40 до 70%, распределенного фокально или диффузно(экспрессия умеренная), 3 – выявление продукта реакции в цитоплазме и ядре более70%, распределенного диффузно (экспрессия выраженная).Экспрессию стероидных рецепторов в ядрах клеток эпителия желез и стромы26оценивали по методу гистологического счета H-score по формуле S=1а+2b+3с, гдеа — слабо окрашенные ядра клеток, %; b — умеренно окрашенные ядра клеток, %;с — сильно окрашенные ядра клеток.
Оценку иммуногистохимической реакции нарецепторы к эстрогенам, андрогенам и прогестерону производили по балльнойсистеме H-score: 0–10 — отсутствие рецепции, 11–100 — слабая рецепция, 101–200— умеренная и 201–300 — выраженная рецепция.Иммуногистохимическиеисследованияпроводилинабазепатологоанатомического отделения федерального научно-клинического центраспециализированных видов медицинской помощи и медицинских технологийфедерального медико-биологического агентства (зав. отделением – д.м.н.,профессор Забозлаев Ф.Г.).Положения, выносимые на защиту:1.ИспользованиерутинногоалгоритмадиагностикиГПЭ(УЗИ,гистероскопия, морфологический метод) в современных условиях не позволяетгарантироватьоптимальныйвыбортактикиведенияпациентокввидуневозможности определения степени активности пролиферативного процесса.Повторные внутриматочные вмешательства, наряду с недооценкой степенипролиферативного риска, создают реальные предпосылки (В=2,03, р<0,001) дляразвития ГПЭ и его онкотрансформации.
Доля риска, которая может бытьустранена при выборе патогенетической терапии, достигает 87%.2.Математическое прогнозирование служит эффективным инструментомвыделения контингентов риска ГПЭ в различные возрастные периоды жизниженщины. Наиболее значимыми (р≤0,01) факторами риска в репродуктивномвозрасте являются прерывания беременности в анамнезе (более 2), воспалительныезаболеваниягениталий,доброкачественныезаболеванияшейкиматки,внутриматочные манипуляции, заболевания эндокринной системы; в переходном—доброкачественныезаболеваниямолочныхжелезишейкиматки,неоднократные внутриматочные вмешательства, в том числе связанные срецидивированием гиперпластического процесса эндометрия; в постменопаузе —заболевания эндокринной системы (ожирение, сахарный диабет, заболевания27щитовиднойжелезы),внутриматочныедоброкачественныевмешательства,заболеваниясвязанныесмолочныхжелез,рецидивированиемгиперпластического процесса эндометрия.3.Ведущим звеном патогенеза ГПЭ в репродуктивном и переходномвозрасте следует считать специфичность генных взаимодействий в системедетоксикации и межклеточных контактов (увеличение активности лизосомальныхферментов GLU) и увеличение продукции эмбриоспецифических аутоантител(гиперреактивность), отражающие интенсивность пролиферативных процессов,что создает предпосылки для погружного роста эпителия и стромы базального слояэндометрия в подлежащий миометрий.
Для женщин в постменопаузе характерныспецифичность генных взаимодействий в системе детоксикации, снижениеактивности лизосомальных ферментов (GLU и ACE) и продукции эмбриотропныхаутоантител (гипореактивность).4.Молекулярныемеханизмырецепторногостатусаиизменениепоказателей пролиферативной активности клеток при гиперплазии эндометрияносят универсальный характер. Особенностями репродуктивного возрастаявляются снижение уровня ER как в железах эпителия, так и в строме эндометрия;переходного и постменопаузального — дисбаланс ER и PR с преобладанием PR.Высокая пролиферативная активность эндометриальных клеток в условияхснижения апоптоза проявляется гиперэкспрессией в биоптатах эндометрия маркерапролиферации Ki67 в клетках эпителия и стромы и снижением маркера апоптозар53, независимо от возраста (р<0,05).5.теченияРазработанный алгоритм ранней диагностики и прогнозированияГПЭ,предусматривающийиспользованиемматематическихвыделениемоделей,контингентовисследованиерискассостоянияиммунореактивности, генетических («ослабленного» аллеля D гена GSTPI,«дикого»аллеляAAгенаCYPIAI,аллеляAIAIIгенаGP-IIIa),иммуногистохимических (ER и PR) и биомолекулярных (Ki67 и р53) маркеровГПЭ, позволяет результативно диагностировать заболевание, определять степеньактивности процесса, прогнозировать течение болезни.Его внедрение в28клиническую практику способствует (р<0,05) снижению частоты рецидивов ГПЭ в2,3 раза, уменьшению затрат на ведение пациенток с ГПЭ независимо от возрастана 36,3%.Степень достоверности и апробация результатов работы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
