Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1154341), страница 5

Файл №1154341 Диссертация (Гиперплазия эндометрия в возрастном аспекте. Генетические, иммунологические и эндокринные детерминанты патогенеза и прогнозирования) 5 страницаДиссертация (1154341) страница 52019-09-14СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 5)

Входящий в состав набора сорбент в количестве 8 мграстворяли в 15 мкл ультрачистой воды (Merck, Германия), после чего полученнуюсуспензию вносили в пробирку с продуктами реакции минисеквенирования.Содержимое пробирки тщательно перемешивали и инкубировали при комнатнойтемпературе 15 мин. Сорбент осаждали центрифугированием в течение 5 мин при1000 об/мин.

Супернатант использовали для масс-спектрометрического анализа.Исследование выполняли на базе иммунологического отделения лаборатории ЗАО«ПИННИ» г. Москвы (директор лаборатории — Третьяков В.Е.).Активность лизосомальных ферментов N–ацетил--D-глюкозаминидазы(АСЕ) и -D глюкуронидазы (GLU) определяли в плазме крови, а также в тканиэндометрия.Забор материала.

2 мл крови отбирали из локтевой вены пациентки впробиркус0,22млрастворацитратанатрия(всоотношении9:1),центрифугировали в течение 5 мин при 2500 об/мин и получали плазму крови дляопределения активности GLU и АCE.Гомогенизация и фракционирование тканей. Ткань эндометрия отмывали23при 0–4°С, промокали фильтровальной бумагой, взвешивали.

Навеска — 0,5 г.Полученные образцы измельчали ножницами и гомогенизировали в стеклянномгомогенизаторе Поттера–Эвелгейма с тефлоновым пестиком (зазор — 0,21 мм) втечение 180 с при 40 об/мин. Гомогенат готовили из расчета 1:10 (масса ткани кобъему гомогенизационного буфера) и подвергали центрифугированию наультрацентрифуге 18-80 М фирмы Beckman (США).В результате второго центрифугирования получали лизосомный супернатант(надосадочную жидкость) и обогащенную лизосомами фракцию (осадок), которуюресуспендировали в соотношении 1:5 в буферном растворе 0,7 М сахароза (х.ч.),1 мМ ЭДТА ("Серва", ФРГ), рН 7,0.

О структурной целостности лизосом судили поуровню активности лизосомных ферментов в различных фракциях.Изучаемые виды активности лизосомных ферментов:А. Свободная, или неседиментируемая, активность (НСА) — активностьферментов, выделившихся в цитозоль, определяемая в супернатанте.Б. Доступная активность (ДА) — активность ферментов, определяемая вобогащенном лизосомами осадке и доступная для субстрата.В.

Общая активность (ОА) — определялась после разрушения лизосомныхмембран методом замораживания–оттаивания обогащенного лизосомами осадка.Исходя из полученных величин активности лизосомных ферментов,рассчитывали следующие показатели:1.Связанная активность (СВА) — разница между общей и доступнойактивностями обогащенного лизосомами осадка:СВА = ОА–ДА;2.Латентность (Л) — разница между общей и доступной активностямиотносительно общей активности (%):Л=3.ОА − ДАх 100%ОАКоэффициент лабилизации лизосомных мембран (КЛЛМ) — долядоступной активности фермента относительно общей (%):КЛЛМ =ДАх 100%ОА244.Коэффициент проницаемости лизосомных мембран (КПЛМ) — долянеседиментируемой активности фермента относительно общей (%):КПЛМ =АктивностьНСАх 100%ОА-D-глюкуронидазы(К.Ф.3.2.1.31.)иN-ацетил--D-глюкозаминидазы (К.Ф.3.2.1.53.) определяли в плазме крови и во всех фракциях,выделенных из ткани эндометрия.1.

Активность-D-глюкуронидазыопределяликолориметрическипоскорости освобождения фенолфталеина из субстрата фенолфталеин-глюкуронида.2. АктивностьN-ацетил--D-глюкозаминидазыопределяликолориметрически по скорости освобождения 4-нитрофенола и субстрата 4нитрофенил-М-ацетил--D- глюкозаминид.Для этого использовали инкубационную смесь: 2 мМ фенолфталеинглюкуронид и 5 мМ 4-нитрофенил-N-ацетил--D-глюкозаминид в 0,2 М ацетатномбуфере, рН 5,5.

При определении ДА в осадочной фракции, обогащеннойлизосомамидлядополнительнойстабилизациилизосомныхмембран,винкубационную смесь вводили 0,7 М сахарозы.К 100 мкл инкубационной смеси добавляли 20 мкл исследуемого материала(для определения ОА и ДА фракции тканей разводят в соотношении 1:5).Инкубация при 37С для материалов из плазмы и тканей 20 мин. Реакциюостанавливали 0,5 мл холодного раствора 1M Na2СО3.Фотоколориметрировали в микрокюветах на спектрофотометре СФ-2000(Cанкт-Петербург) при длине волны 405 нм (N-ацетил--D-глюкозаминидаза) и 555нм (-D-глюкуронидаза). В контрольном опыте исследуемый материал добавлялипослеостановкиреакции.Опытныйиконтрольныйобразцыспектрофотометрировали против компенсационного раствора, содержащего 20 мклсоответствующего гомогенизационного буфера, 100 мкл 0,2 М ацетатного буфера,рН 5,5, 0,7 М сахароза и 0,5 мл М Na2СО3.Коэффициенты молярной экстинкции 4-нитрофенол и фенолфталеинаопределяли по стандартным кривым, построенным при фотометрировании25стандартных растворов 4-нитрофенола ("Реахим") и фенолфталеина ("Реахим") в 1М Na2СО3.Активность ферментов выражали в нмоль освобожденного за 1 мин изсубстрата 4-нитрофенола или фенолфталеина на 1 мг белка в исследуемомматериале.

Количество белка в пробе определяли по методу Lowry в модификацииС.П. Сяткина.Исследованиевыполненонабазеиммунологическогоотделениялаборатории ЗАО «ПИННИ» г. Москвы (директор лаборатории — Третьяков В.Е.).Иммуногистохимическиеметодыисследованиявключалииммуногистохимический анализ содержания эстрогеновых (ER), прогестероновых(PR) рецепторов в ткани эндометрия. В качестве первичных антител использовалимоноклональные кроличьи антитела против anti-Progesterone Receptor (1E2); antiEstrogen Receptor (SP1) (Ventana); моноклональные кроличьи антитела против antiandrogenReceptor(SP107)производстваSpringBiocience.Оценкуиммуногистохимической реакции оценивали полуколичественным методом,используя стандартный подход — подсчет числа клеток, экспрессирующих маркерна 100 клеток в 10 полях зрения.Результаты иммуногистохимической реакции оценивали в баллах по шкалеAllred (сумма баллов количества иммуноокрашенных клеток и интенсивностиокрашивания).

Для этого количество ИГХ-позитивных клеток оценивали в баллахследующим образом: 0=0% клеток, 1=0,1–1% клеток, 2=2–10% клеток, 3=11–33%клеток, 4=34–66% клеток, 5=67–100% клеток, а интенсивность окрашиванияоценивали в баллах следующим образом: 0 – полное отсутствие продукта реакцииили выявление его в цитоплазме и ядрах менее 5% (экспрессия отсутствует), 1 –выявление продукта реакции в цитоплазме и ядре от 5 до 40%, распределенногофокально или диффузно (экспрессия слабая), 2 – выявление продукта реакции вцитоплазме и ядре от 40 до 70%, распределенного фокально или диффузно(экспрессия умеренная), 3 – выявление продукта реакции в цитоплазме и ядре более70%, распределенного диффузно (экспрессия выраженная).Экспрессию стероидных рецепторов в ядрах клеток эпителия желез и стромы26оценивали по методу гистологического счета H-score по формуле S=1а+2b+3с, гдеа — слабо окрашенные ядра клеток, %; b — умеренно окрашенные ядра клеток, %;с — сильно окрашенные ядра клеток.

Оценку иммуногистохимической реакции нарецепторы к эстрогенам, андрогенам и прогестерону производили по балльнойсистеме H-score: 0–10 — отсутствие рецепции, 11–100 — слабая рецепция, 101–200— умеренная и 201–300 — выраженная рецепция.Иммуногистохимическиеисследованияпроводилинабазепатологоанатомического отделения федерального научно-клинического центраспециализированных видов медицинской помощи и медицинских технологийфедерального медико-биологического агентства (зав. отделением – д.м.н.,профессор Забозлаев Ф.Г.).Положения, выносимые на защиту:1.ИспользованиерутинногоалгоритмадиагностикиГПЭ(УЗИ,гистероскопия, морфологический метод) в современных условиях не позволяетгарантироватьоптимальныйвыбортактикиведенияпациентокввидуневозможности определения степени активности пролиферативного процесса.Повторные внутриматочные вмешательства, наряду с недооценкой степенипролиферативного риска, создают реальные предпосылки (В=2,03, р<0,001) дляразвития ГПЭ и его онкотрансформации.

Доля риска, которая может бытьустранена при выборе патогенетической терапии, достигает 87%.2.Математическое прогнозирование служит эффективным инструментомвыделения контингентов риска ГПЭ в различные возрастные периоды жизниженщины. Наиболее значимыми (р≤0,01) факторами риска в репродуктивномвозрасте являются прерывания беременности в анамнезе (более 2), воспалительныезаболеваниягениталий,доброкачественныезаболеванияшейкиматки,внутриматочные манипуляции, заболевания эндокринной системы; в переходном—доброкачественныезаболеваниямолочныхжелезишейкиматки,неоднократные внутриматочные вмешательства, в том числе связанные срецидивированием гиперпластического процесса эндометрия; в постменопаузе —заболевания эндокринной системы (ожирение, сахарный диабет, заболевания27щитовиднойжелезы),внутриматочныедоброкачественныевмешательства,заболеваниясвязанныесмолочныхжелез,рецидивированиемгиперпластического процесса эндометрия.3.Ведущим звеном патогенеза ГПЭ в репродуктивном и переходномвозрасте следует считать специфичность генных взаимодействий в системедетоксикации и межклеточных контактов (увеличение активности лизосомальныхферментов GLU) и увеличение продукции эмбриоспецифических аутоантител(гиперреактивность), отражающие интенсивность пролиферативных процессов,что создает предпосылки для погружного роста эпителия и стромы базального слояэндометрия в подлежащий миометрий.

Для женщин в постменопаузе характерныспецифичность генных взаимодействий в системе детоксикации, снижениеактивности лизосомальных ферментов (GLU и ACE) и продукции эмбриотропныхаутоантител (гипореактивность).4.Молекулярныемеханизмырецепторногостатусаиизменениепоказателей пролиферативной активности клеток при гиперплазии эндометрияносят универсальный характер. Особенностями репродуктивного возрастаявляются снижение уровня ER как в железах эпителия, так и в строме эндометрия;переходного и постменопаузального — дисбаланс ER и PR с преобладанием PR.Высокая пролиферативная активность эндометриальных клеток в условияхснижения апоптоза проявляется гиперэкспрессией в биоптатах эндометрия маркерапролиферации Ki67 в клетках эпителия и стромы и снижением маркера апоптозар53, независимо от возраста (р<0,05).5.теченияРазработанный алгоритм ранней диагностики и прогнозированияГПЭ,предусматривающийиспользованиемматематическихвыделениемоделей,контингентовисследованиерискассостоянияиммунореактивности, генетических («ослабленного» аллеля D гена GSTPI,«дикого»аллеляAAгенаCYPIAI,аллеляAIAIIгенаGP-IIIa),иммуногистохимических (ER и PR) и биомолекулярных (Ki67 и р53) маркеровГПЭ, позволяет результативно диагностировать заболевание, определять степеньактивности процесса, прогнозировать течение болезни.Его внедрение в28клиническую практику способствует (р<0,05) снижению частоты рецидивов ГПЭ в2,3 раза, уменьшению затрат на ведение пациенток с ГПЭ независимо от возрастана 36,3%.Степень достоверности и апробация результатов работы.

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Почему делать на заказ в разы дороже, чем купить готовую учебную работу на СтудИзбе? Наши учебные работы продаются каждый год, тогда как большинство заказов выполняются с нуля. Найдите подходящий учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6376
Авторов
на СтудИзбе
309
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее