Диссертация (1150552), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Результат показан на Рисунок 2.14B и представленчерными вертикальными линиями. Как можно видеть, наиболее часто встречающиеся частицысостоят из 2-х или 3-х цепей, однако более крупные агрегаты также распространены. Массоваядоля дисульфид-связанных димеров равна 17%, тогда как все другие АЧ в сумме дают 83% отмассы агрегатов. В принципе, неупорядоченные димеры или тримеры RRM2 должнынаблюдаться в экспериментах ЯМР. Однако, как уже отмечалось, эти частицы являютсяслишком неоднородными и в них отсутствует динамическое усреднение конформаций, котороеделает невозможным их наблюдение с помощью спектроскопии HSQC высокого разрешения.73Рисунок 2.14. Распределение размеров для агрегатных частиц в полностью окисленном образцеRRM2. (A) (), полученная путем оптимизации двух параметров в уравнении 6: = 8,5 Å, = 28,6 Å.
Последнее значение соответствует минимальному уровню гидратации 2,68 г/г длянеупорядоченного дисульфид-связанного димера RRM2. Желтые кривые отражают результатымоделирования методом Монте-Карло на основе экспериментальных погрешностей: 0,01 · 10-10и 0,02 · 10-10 м2/с для ,и ,, соответственно. Показаны только те кривые, длякоторых значения обоих аппроксимированных параметров (), находятся в пределах одногостандартного отклонения от соответствующих аппроксимированных значений. (B) Функцияраспределения Λ(), показывающая долю АЧ, состоящих из п пептидных цепей (черныевертикальные линии) и Ω(), показывающая долю дисульфид-связанных п-меров (красныеточки). Функция Λ() рассчитывалась из () в предположении, что (i) минимальный уровеньгидратации для АЧ(п) является одинаковым для всех п, 2,68 г/г, и (ii) максимальногидратированная АЧ(п) имеет тот же размер, что и минимально гидратированная АЧ(п + 1).Данные для Ω() были получены из анализа денситометрии невосстанавливающего ДСНПААГ полностью окисленного образца RRM2, см.
Рисунок 2.13.Кроме того, наРисунок2.14Bпоказаны результаты анализа денситометрииневосстанавливающего ДСН-ПААГ из Рисунок 2.13. Эти данные непосредственно сообщают одоле дисульфид-связанных п-меров в образце, что соответствует функции распределения Ω()(обозначена красными точками на графике). Вообще говоря, Ω() отличается от Λ() и простойсвязи между этими двумя функциями не существует (на самом деле, агрегатные частицы могутбыть собраны из различных комбинаций дисульфид-связанных димеров, тримеров и т.д., атакже мономерных цепей).
Тем не менее, в нашем случае, две функции во многом схожи, чтопредставляет собой удовлетворительный результат, учитывая, что дисульфид-связанные п-мерыявляются основным элементом агрегатных частиц.74Мы также протестировали ряд других простых моделей () в дополнение к уравнению(2.6). Результаты не были удовлетворительными. Например, с помощью двух-параметрическойпрямоугольной функции распределения не удалось точно воспроизвести ,и ,.Такой же результат был получен для двухпараметрической функции распределения Флори~ exp(− 3 ). Трехпараметрическая смещенная лог-нормальная модель дает очень узкоераспределение, которое не согласуется с результатами ДСН-ПААГ.
Некоторые другие моделибыли также проверены и отклонены по различным причинам.Эмпирическая функция (), показанная на Рисунок 2.14, конечно, имеет своиограничения. Это, по существу, упрощенная реконструкция функции распределения поразмерам, которая построена для воспроизведения двух экспериментальных коэффициентовдиффузии (то есть двух различных функционалов от распределения). Тем не менее, онапредлагает довольно реалистичное описание агрегатных частиц в образце окисленного RRM2, всоответствии с тем, что мы знаем о природе неупорядоченных АЧ, и подтверждается даннымиДСН-ПААГ. Как обсуждалось выше, наш подход содержит лишь немного предвзятости вотношении выбора модели, поэтому результаты на Рисунок 2.14 можно рассматривать какразумное приближение к истинному распределению по размерам агрегатных частиц.2.3.6.
RRM2 в окисленном образце уязвим к трипсинолизуСтруктурная стабильность частиц, которые образуются после обработки образца RRM2 спомощью H2O2, была исследована с помощью трипсинолиза. Трипсин расщепляет свойсубстрат со стороны С-конца после аминокислотных остатков аргинин или лизин;эффективность расщепления зависит от экспонированности на поверхность и гибкости области,содержащей сайт разрезания.
Ограниченный трипсинолиз является чувствительным способомисследования структурированности белка [121]. Аминокислотная последовательность RRM2содержит четыре аргинина и четыре лизина. При полном расщеплении RRM2 разделяется нанесколько пептидов, причем самый большой фрагмент имеет массу 2,5 кДа. Пептиды этогоразмера трудно обнаружить с помощью гель-электрофореза, но легко наблюдать с помощьюЯМР. И наоборот, гель-электрофорез легко обнаруживает дисульфид-связанные олигомеры(если они выдерживают обработку трипсином), что оказывается невозможным в экспериментахЯМР.
Таким образом, комбинация ДСН-ПААГ и спектроскопии HSQC хорошо подходит длямониторинга процесса трипсинолиза.75Результаты контролируемых экспериментов по трипсинолизу проиллюстрированы наРисунок 2.15. Контрольный образец RRM2, по-видимому, устойчив к трипсинолизу (дорожка3), в то время как окисленный образец измельчается на пептиды (дорожка 4). Этот результатнаводит на мысль, что агрегированные частицы RRM2 сильно разупорядочены. Это делает ихвосприимчивыми к протеолизу [122]. На геле не наблюдаются триптические пептиды, однакоон содержит слабую полоску для белковых частиц с молекулярной массой между мономером идимером (скорее всего, укороченный вариант дисульфид-связанного димера).
Дорожка 4 такжесодержит пару очень слабых полос, которые соответствуют мономерному RRM2, а также егослегка усеченной версии. Следует отметить, что содержание мономерного белка значительноснижается после обработки трипсином (см. дорожки 2 и 4). Этот результат являетсянетривиальным, учитывая, что глобулярный мономерный RRM2 является устойчивым ктрипсинолизу (дорожка 3).
Это заставляет предположить, что мономерный RRM2 в окисленномобразце существует в состоянии динамического обмена между глобулярной формой, где онзащищен от протеолиза, и формой АЧ, где он восприимчив к протеолизу. Это наблюдениесогласуется с нашим выводом из экспериментов по H/D обмену.
Механизм этого процессаобмена будет подробнее описан ниже.Рисунок 2.15. Трис-трициновый ДСН-ПААГ анализ продуктов расщепления трипсином дляокисленного и контрольного образцов RRM2. Дорожка 1: контроль, нерасщепленный; 2:окисленный, нерасщепленный; 3: контроль, расщепленный; 4: окисленный, расщепленный; 5:маркер. Окисленный образец был обработан с помощью 5 мМ H2O2 в течение 2 ч, а затем былапроизведена замена буфера; контрольные образцы были обработаны с помощью 25 мМ DTT втечение 2 ч, а затем была произведена замена буфера.
Другие детали эксперимента описаны вразделе 2.2. Материалы и методы.Альтернативная версия эксперимента по трипсинолизу использует детектирование спомощью ЯМР, см. Рисунок 2.16. Панели (A) и (B) на этом рисунке иллюстрируют реакцию76свежеприготовленного (неокисленного) образца RRM2 на обработку трипсином. Восьмичасовая инкубация с трипсином практически не оказывает влияния на спектр HSQC образца,тем самым подтверждая, что глобулярный RRM2 структурно стабилен и устойчив кпротеолизу. Единственное повреждение, причиненное глобулярному домену RRM2, повидимому, - отсечение двух крайних остатков от гибкого С-конца. Расщепление происходитпосле остатка K263 и вызывает исчезновение спектральных пиков K263 и N265 (отмечены нарисунке). В целом, результат согласуется с данными ДСН-ПААГ и предоставляет подробнуюинформацию о каждом аминокислотном остатке.Панели (C) и (D) на Рисунок 2.16 иллюстрируют реакцию окисленного образца (2 ч) наобработку трипсином. Как было отмечено ранее, окисление образца вызывает равномерноеуменьшение интенсивности спектральных пиков, относящихся к глобулярному мономерномуRRM2, но в остальном оказывает незначительное влияние на спектр HSQC, см.
Рисунок 2.16C.Тем не менее, добавление трипсина к окисленному образцу приводит к резким изменениям вспектре. Конкретнее, сигналы от глобулярного мономерного RRM2 больше не наблюдаются, вто время как вновь появившиеся спектральные пики сгруппированы в узком интервалехимических сдвигов протонов около 8,3 м.д.. Результирующий спектр характерен для смесиразнообразных неструктурированных пептидов, см. Рисунок 2.16D.77Рисунок 2.16.
ЯМР характеризация продуктов расщепления RRM2 после обработкитрипсином: (A,В) контрольный образец до и после обработки трипсином; (С,D) окисленныйобразец до и после обработки трипсином; (Е,F) восстановленный образец до и после обработкитрипсином. Экспериментальные подробности описаны в секции 2.2. Материалы и методы.Пары спектров от образцов с одинаковыми состояниями окисления построены с одинаковымуровнемотсечкидляконтурногографика.Важныесигналыобозначенычерными78треугольниками или красными стрелками.Наконец, мы переходим к образцу, который был сначала окислен и затем восстановлен,панели (Е) и (F).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
