Диссертация (1150552), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Обработкутрипсином проводили при 37°С с отношением массы трипсина к белку 1:50.В отдельной серии измерений расщепление RRM2 трипсином наблюдали с помощьюспектроскопии HSQC. Образцы первоначально подготавливались следующим образом.Контрольный образец (неокисленный): инкубировался в течение 2 ч с 25 мМ DTT; первыйрабочий образец (окисленный): инкубировался в течение 2 ч с 5 мМ H2O2, H2O2 удаляласьультрафильтрацией; второй рабочий образец (восстановленный): инкубировался в течение 2 ч с5 мМ H2O2, затем инкубировался в течение 3 ч с дополнительными 25 мМ DTT. Для каждого изобразцов мы впоследствии регистрировали реперный спектр HSQC, затем добавляли трипсин иполучали серию из двенадцати записанных подряд HSQC-спектров.
Записанные спектрыпозволили наблюдать ход триптического расщепления в течение 8 ч. Трипсинолиз проводили встандартном (фосфатном) буфере при 37°С с концентрацией белка 1 мМ и соотношением массытрипсина к белку 1:50.Молекулярная динамикаМоделирование МД проводилось в силовом поле Amber ff14SB с моделью воды TIP3P сиспользованием ансамбля NPT. Термостат Ланжевена с частотой столкновений 2 пс-1использовался для поддержания постоянной температуры 298К.
Для нековалентныхвзаимодействий использовалась отсечка в 10,5Å; дальнодействующие электростатическиевзаимодействия учитывались методом Эвальда. Все связи с атомами водорода былиограничены с использованием алгоритма SHAKE. Шаг интеграции составлял 2 фс.Для построения исходных моделей домена RRM2 использовались две структуры PDB:1WF0 (последовательность, аналогичная человеческому TDP-43193-267, решена методом ЯМРспектроскопии) и 3D2W (мышиный TDP-43192-265, решена рентгеновской кристаллографией).Первая из них была изменена с помощью PyMOL mutagenesis tool, чтобы точно воспроизвести44последовательность, используемую в нашем исследовании (4 мутации). Части пептидной цепи,которые не содержатся в нашей экспериментальной конструкции, были удалены из 1WF0;олигонуклеотидный лиганд был удален из 3D2W. Состояние протонирования белка былоприведено в соответствие с рН 7 с помощью программы PROPKA [90, 91].В качестве первого шага были построены модели димеров RRM2, ковалентно связанныечерез дисульфидный мостик C244-C244.
Для этого две идентичные единицы RRM2(называемые α и β) были расположены друг напротив друга, так, что их соответствующиецентры масс и атомы серы С244 лежали на прямой и расстояние между атомами серы былоравно 20Å. Затем выполнялись два случайных вращения: во-первых, β-единица вращаласьвокруг своего собственного центра масс; во-вторых, она вращалась вокруг центра масс αединицы. Оси обоих поворотов были выбраны случайным образом, а амплитуда быласлучайным числом, подчиняющимся нормальному распределению со средним значением 0° истандартным отклонением 45°.В качестве следующей стадии моделировалось образование дисульфидных связей сиспользованием модифицированного варианта метода ограниченной МД, разработанного MartíRenom и др.
[92]. В этом методе два атома серы медленно стягиваются друг к другу с помощьюспециально введенных мягких удерживающих ограничений. Образование дисульфидной связиинициируется, когда два атома серы приближаются друг к другу на расстояние меньше 2,5 Å.Чтобы минимизировать возмущения энергии, связь вводится постепенно, т.е. линейноувеличиваются соответствующие элементы потенциала [93]. В течение всей процедуры мыподдерживаем набор синтетических ограничений расстояний, предназначенных для сохранениявнутренней структуры единиц RRM2 (в частности, все внутренние расстояния C α-Cαудерживаются путем гармонических потенциалов с k = 0,1 ккал/моль·Å2). Суммарная длинасимуляций, приводящих к образованию дисульфидной связи, составляет ок.
5-10 нс, чтосогласуется с процессом, контролируемым диффузией.Используя этот протокол, мы создали 50 моделей дисульфид-связанных димеров RRM2.Из этого набора мы выбрали подмножество из 5 максимально разнообразных моделей (спопарным Cα RMSD > 10 Å между любыми двумя моделями в подмножестве). Выбранныемодели обеспечивают достаточно хорошую выборку в отношении взаимной ориентации двухединиц в димере и, таким образом, были использованы в качестве начальных координат длямоделирования МД. Каждая симуляция начинается с 20 нс, в течение которых синтетическиеограничения Cα-Cα постепенно снимаются, а затем записывается обычная МД длиной 1 мкс.45Всего было записано 10 таких траекторий на основе геометрий 1WF0 и 3D2W. Кроме того,записаны две контрольные траектории для мономерного RRM2 на основе тех же геометрий.Чтобы проанализировать устойчивость доменных структур в дисульфид-связанныхдимерах RRM2 в сравнении с мономерами, мы использовали два параметра: C α RMSD икоэффициенты защиты от амидного обмена Pf.
Для вычисления Cα RMSD две доменныеструктуры были выровнены по атомам Cα из областей вторичной структуры соответствующегодомена, а среднее отклонение координат было определено для одного и того же подмножестваатомов Cα. Данные Pf были рассчитаны с использованием эмпирического алгоритма Best иVendruscolo [94]. В этом расчете водородные связи были идентифицированы с использованиемпростого геометрического критерия: расстояние между азотом и кислородом менее 3,5 Å иотклонение от линейности менее 30°.
Значения Pf вычислялись с использованием серии МДкадров, отобранных с шагом 10 пс и затем усредненных по всей траектории.2.3. Результаты и обсуждение2.3.1. Обработка H2O2 вызывает образование дисульфид-связанных олигомеров вобразце RRM2RRM2 конструкция, которая используется в данном исследовании, - это глобулярныйдомен из 76 аминокислотных остатков с укладкой ферредоксинового типа β1α1β2β3α2β4β5[95]. Он содержит два цистеина, C198 и C244 (нумерация производится по полноразмерномуTDP-43, см. Рисунок 2.2A). Тиольная группа C198 погружена внутрь белка, в то время кактиольная группа C244 в значительной степени экспонирована в растворитель (см.
Рисунок2.2B). Этот параметр удобно количественно определить с использованием площадиповерхности доступной растворителю. Расчет с использованием ЯМР-ансамбля 1WF0показывает, что атом SG остатка C198 ориентирован внутрь белка. Для него 1% площадидоступен растворителю, тогда как атом SG остатка C244 часто экспонируется в растворитель сосредним значением площади доступной растворителю в 24%. Как выяснилось, C244 можетобразовывать межмолекулярный дисульфидный мостик, сохраняя нативную конформациюбелка (см.
ниже обсуждение результатов моделирования МД).46Рисунок 2.2. (A) Схематическое представление TDP-43, включая убиквитин-подобный Nконцевой домен (ND) [96], два РНК-распознающих мотива (RRM1 и RRM2) [97] и богатыйглицином домен (GRD) [98]. В схеме отмечены сигналы ядерной локализации и ядерногоэкспорта (соответственно NLS и NES) [99], а также два цистеина в домене RRM2.Структурированные и неупорядоченные сегменты окрашены в синий и серый цветасоответственно.
(B) Структура RRM2 (PDB ID 1WF0) с двумя боковыми цепями цистеина. (C)ДСН-ПААГ характеризация образцов WT, C198S и C244S в невосстанавливающих условиях.Образцы были подвергнуты окислению (2 часа с 5 мМ H2O2) или окислению и последующемувосстановлению (3 часа с 25 мМ DTT). Следует отметить, что дисульфид-связанные n-мерыRRM2 ( ≥ 2) показывают на геле более низкую, чем ожидается, видимую молекулярнуюмассу. Это довольно типичное поведение, поскольку дисульфид-связанные белки болеекомпактны и, следовательно, быстрее мигрируютчерезгель[100]. Доказательстводисульфидной димеризации RRM2 также были получены с помощью масс-спектрометрии ESI(данные не показаны). Наша модель окислительного стресса in vitro с использованием H2O2 вобщем случае груба.
Тем не менее, очевидно актуальна в контексте TDP-43 протеинопатий:дисульфид-опосредованная агрегация TDP-43 была обнаружена не только в культивируемыхклетках, трансфецированных плазмидой TDP-43, но также и в нетрансфецированных клетках,подвергнутых к окислительному стрессу; кроме того, сшитые дисульфидными связямивключения TDP-43 распространены в мозге, пораженном TDP-43-положительной лобновисочной дегенерацией [24].Рисунок 2.2C иллюстрирует эффект окислителя (H2O2) на дикий тип RRM2, а такжеварианты RRM2 с одним цистеином.
Данные невосстанавливающего денатурирующегобелкового геля ДСН-ПААГ сообщают о дисульфидной олигомеризации RRM2, но не дают47никакой информации о нековалентной самоассоциации. Окисление белка дикого типа даетхарактерный «паттерн-лестницу» олигомерных частиц на геле (дорожка 3). Интенсивностиполос свидетельствуют о том, что доля сшитых молекул белка меньше, чем доляодноцепочечных частиц. Появление тримеров и олигомеров высших порядков в гелепредполагает, что домен RRM2 становится (по крайней мере, частично) развернутым во времяэксперимента, таким образом, экспонируя тиольную группу C198 и облегчая процессобразованиядисульфиднойсвязичерезэтотаминокислотныйостаток.Образованиемежмолекулярных дисульфидных связей через С198 в основном происходит в структурноразупорядоченных агрегатных частицах (обсуждается в дальнейшем).Данные для двух мутантных образцов C198S и C244S проливают свет на эффективностьдисульфидногосвязываниячерездваотдельныхцистеина.Визуальныйанализфотографического изображения геля не может быть полностью достоверен, однако анализденситометрии показывает, что доля ковалентных димеров в образце C198S (дорожка 6) в 2,5раза выше, чем в образце C244S (дорожка 9).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
