Диссертация (1150552), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Это соответствует ожиданиям, учитывая разницув расположении соответствующих тиольных групп (см. выше). Стоит отметить, что скоростьобразования дисульфидной связи зависит от многих факторов в дополнение к стерическимограничениям. Например, эффективность реакции может быть снижена из-за высокого pKaтиола [101, 102].
Наоборот, эффективность может быть увеличена, если образованиепромежуточных продуктов реакции, то есть тиолят-иона или сульфеновой кислоты [103],оказывает дестабилизирующее воздействие на структуру, что приводит к большей экспозицииреактивного участка. Последний сценарий, в принципе, возможен для C198, которыйоказывается чувствительным к возмущениям.
Действительно, мутация C198 на серин приводитк значительной потере стабильности белка (см. данные H/D обмена ниже).2.3.2. HSQC-спектроскопия показывает наличие мономеров и агрегатных частицRRM2.Стоит отметить, что1H,15N HSQC спектр wt RRM2 (неокисленного) содержитнеравномерное распределение интенсивностей пиков, см. Рисунок 2.3A. Этот эффект можетбыть связан с самоассоциацией с низким сродством, как описано для многих глобулярныхбелков при высоких концентрациях, обычно используемых в спектроскопии ЯМР [104, 105].
Всоответствии с этой интерпретацией, время корреляции переориентационного движения wtRRM2, полученное из данных15N 2 /1 на образце с концентрацией 1 мМ = 5,3 нс,несколько больше, чем значение, предсказанное программой HYDRONMR, – 4,6 нс [106]. В48согласии с этими наблюдениями, несколько остатков в RRM2 показывают небольшие, ноизмеряемые эффекты титрования химического сдвига с увеличением концентрации белка (вчастности, V195 и A230, которые расположены напротив друг друга в тяжах β1 и β3). Однаконет оснований думать, что слабая самоассоциация, наблюдаемая в мономерном RRM2,оказывает какое-либо значительное влияние на последствия окисления цистеина, которыеподробно описаны ниже.Рисунок 2.3.
(A) 1H,15N BEST-HSQC спектр неокисленного (контрольного) образца wt RRM2.(B) Понижение интенсивности спектральных пиков в спектре 1H,15N BEST-HSQC после 2часовой обработки 5 мМ H2O2. С целью исправить небольшие системные различия междудвумя измерениями (до и после окисления), например небольшие изменения объема образца,шимирование и т.д., мы использовали сигнал от внутреннего эталона,15N-меченного NAG(отмечен на спектре). Согласно этим данным, после двухчасового окисления популяция49мономерного глобулярного RRM2 снижается до уровня 40%.
Соответствующее значение длянестабильного мутанта C198S составляет 28%, тогда как для C244S она составляет 98%(последний, как и ожидалось исходя из структуры глобулярного RRM2, не предрасположен кобразованию дисульфидных мостиков через единственный тиольный сайт C198). (C) Данныео поперечной кросс-корреляции двух механизмов релаксации (анизотропия химическогосдвига и диполь-дипольный) для остатка E209 в контрольных и окисленных образцах RRM2(красные и синие кривые, соответственно).
На рисунке показано отношение интенсивностейвысокопольного и низкопольного компонентов в дублете[83]. (D) Наложение115N в зависимости от задержки ΔH,15N HSQC-спектров для неокисленного образца и полностьюокисленного образца после 24-часовой инкубации с 5 мМ H2O2 (красные и синие контурныелинии, соответственно). Отметим, что высокоподвижный концевой остаток N265 даетсильный пик в обычном эксперименте HSQC, но не в BEST-HSQC, вероятнее всего, из-заобмена амидного протона с растворителем [107]. Небольшое различие в положении пикаN265 в контрольных спектрах, (А) и (D), произошло из-за титрования соседнего гистидинаH264 (номинальный рН нашего образца, 6,7, близок к pKa боковой цепи, как правило, 6,6[108], что делает химические сдвиги соседних аминокислотных остатков чувствительнымидаже к незначительным изменениям рН образца [109].После добавления к образцу RRM2 5 мМ H2O2, интенсивность HSQC спектрапостепенно уменьшается.
Все пики ослабляются почти единообразно, см. Рисунок 2.3B. Длядальнейшего анализа этого эффекта, мы измерили скорости релаксации [83] в контрольноми окисленном образцах RRM2 (см. Рисунок 3C). Этот эксперимент имеет преимуществонечувствительности к обменному уширению, которое потенциально может осложнитьситуацию для системы, испытывающей различные события on-off обмена. Измеренныескорости в окисленном образце RRM2 практически неотличимы от таковых в контрольномобразце: 3,9 против 3,7 с-1 (после усреднения по всем спектральным сигналам, отмеченным наРисунок 2.3А). Это означает, что наблюдаемый спектр генерируется одними и теми жемономерными частицами.
Более конкретно, это позволяет исключить возможность того, чтодисульфид-связанные димеры, такие, как показаны на Рисунок 2.1, могут внести свой вклад винтенсивность пиков в спектре окисленного RRM2. Тут целесообразно провести сравнение субиквитином, идентичным по размеру RRM2 белком. Молекулярные массы для убиквитина иRRM2 составляют 8,5 и 8,7 кДа, соответственно.
Убиквитин также испытывает слабые эффектысамоассоциации. Наши измерения на образце 1 мМ убиквитина показали среднюю скорость = 3,8 с-1. Это значение такое же, как и для RRM2, и четко подтверждает, что RRM2 находится вмономерной форме, в соответствии с тем, что было предположено выше.50В свете этих результатов, уменьшение интенсивности сигналов HSQC просто отражаетисчезновение глобулярного мономерного RRM2, который постепенно становится окисленным,преобразуется в олигомерные частицы и захватывается в агрегатные частицы.
Данные ЯМРпоказывают, что после 2 часов окисления большая часть белковых молекул захватывается АЧ(см. Рисунок 2.3B). Однако данные SDS-PAGE показывают, что дисульфид-связанныеолигомеры составляют минорную фракцию к тому же моменту времени после окисления (см.Рисунок 2.2C). Это приводит заключению, что АЧ состоят не только из дисульфид-связанныхчастиц олигомеров, но и содержат определенную долю одноцепочечных пептидов (показано наРисунок 2.1). Эта точка зрения надежно подтверждается данными для мутанта C198S.Как показано ниже, окисленный образец содержит значительную долю мелких частиц(начиная с дисульфид-связанных димеров), наряду с более тяжелыми АЧ.
В принципе, димерыи тримеры RRM2 достаточно малы, чтобы произвести узкие спектральные сигналы ЯМР. Темнеменее,этичастицыоказываютсянеупорядоченнымиисильнонеоднородными.Следовательно, они дают чрезвычайно широкие (неразрешенные) спектральные сигналы,которые занимают область спектра типичного неупорядоченных белков и едва поднимаютсянад уровнем шума. Это проиллюстрировано на Рисунок 2.4, который показывает спектр HSQCзаписанный после 24 часов инкубации образца RRM2 с 5 мМ H2O2.
По-видимому, олигомерныечастицы низкого порядка не имеют достаточно быстрой конформационной динамики, котораямогла бы усреднить конформационную неоднородность и сузить спектральные сигналы (в этомсмысле они отличаются от многих неупорядоченных белков, которые дают хорошоразрешенные спектры).A51BРисунок 2.4. (A) 1H,15N HSQC-спектр образца RRM2, обработанный 5 мМ H2O2 в течении 24 ч.Уровень отсечки для контуров установлен вблизи уровня шума, чтобы показать широкие пики снизкой интенсивностью от олигомерных и агрегатных частиц.
Ряд небольших острых пиковможно отнести к 4,5% фракции глобулярного мономерного RRM2 в образце. Спектр былзаписан за 1 час 20 мин. (B) Проекция спектра 1H,15N HSQC на ось 1H для контрольного иокисленного (24 ч) образцов RRM2 (красная и синяя линии, соответственно). В спектреокисленного RRM2 виден широкий пик, который отражает конформационную неоднородностьагрегатных частиц и их большую массу.В итоге, спектр полностью окисленного RRM2 оказывается чрезвычайного низкогокачества из-за неоднородности олигомерных и агрегатных частиц и, кроме того, большоймолекулярной массы более крупных АЧ.
Тем не менее, несколько хорошо разрешенных пиковмогут быть отнесены к окисленному RRM2, как показано на Рисунок 2.3D. В частности,отдельный пик от C-концевого остатка 265 можно увидеть в спектральной карте (отмеченN265'). В свернутом RRM2, N265 находится на конце разупорядоченного хвоста длиной в 5аминокислотных остатков, который сольватирован и весьма подвижен. Когда белок окисляетсяи захватывается в АЧ, терминальный остаток, по-видимому, по прежнему остаетсясольватированным и динамичным. Из-за однородного характера его окружения (растворитель)и быстрого движения, этот остаток дает довольно узкий спектральный сигнал. Хотя пик N265'(полностью окисленный образец) несколько шире, чем пик N265 (контрольный образец),объемы двух пиков практически идентичны.
В частности, для спектров, показанных на Рисунок2.3D, отношение соответствующих объемов пиков равно 1,02. Этот результат имеет важныепоследствия. Он означает, что в полностью окисленном образце наблюдается спектральный52сигнал от всех аспарагинов на C-конце, без какой-либо выборки или ослабления. Эта ситуацияпоказана на Рисунок 2.1: остаток 265 является неизменно сольватированым и подвижным дляразных видов RRM2: от дисульфид-связанных димеров до тяжелых АЧ.
Это делает N265'хорошим зондом [110] для измерения диффузии в агрегированном RRM2 и дальнейшейхарактеризации распределения по размерам агрегатных частиц (см. ниже). В то же время,сигналы от глобулярных мономерных частиц слишком слабы в спектре полностью окисленногообразца RRM2 и не могут быть использованы в контексте PFGSTE ЯМР эксперимента.Наконец, мы переходим к обсуждению восстановленных образцов, то есть тех образцов,которые были первоначально обработаны H2O2 и после этого восстанавлены DTT. Как будетпродемонстрировано в следующем разделе, в этих условиях АЧ частично разрушаются, а долясвернутых мономеров RRM2 увеличивается.
Тем не менее, небольшая часть мелких АЧсохраняется и оказывается устойчивой к обработке DTT (показано на Рисунок 2.1). С точкизрения ЯМР спектроскопии, эта ситуация не является особенно благоприятной, поскольку пикN265' (агрегатные частицы), частично перекрывается с гораздо более сильным пиком N265(свернутый мономер RRM2) , см. Рисунок 2.5. По этой причине мы не пытались провестикакие-либо измерения диффузии с помощью ЯМР на остаточных АЧ, обнаруженных ввосстановленном образце. Тем не менее, собранные данные HSQC позволили нам точноопределить долю мономеров RRM2 в восстановленном образце.
Она составляет 84% (± 4%).Кроме того, в этих условиях коэффициент диффузии глобулярных мономерных частиц былуспешно измерен.53Рисунок 2.5. Наложенные части 1H,15N HSQC-спектров полностью окисленного образца RRM2(5 мМ H2O2 в течение 24 ч) и восстановленного образца RRM2 (5 мМ H2O2 в течение 24 ч, затем25 мМ DTT в течение 24 часов). Спектры окрашены в синий и красный цвета, соответственно.Спектр восстановленного образца показывает два частично перекрытых сигнала N265 и N265'.2.3.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
