Диссертация (1150552), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Перед измерениями DTT удалялся изобразцов ультрафильтрацией. Образцы с концентрацией белка 1 мМ готовили следующимобразом. Контрольный образец: инкубировался в течение 5 ч с 25 мМ DTT; окисленныйобразец: инкубировался в течение 2 ч с 5 мМ H2O2; восстановленный образец: инкубировался втечение 2 ч с 5 мМ H2O2, затем инкубировался в течение 3 ч с 25 мМ DTT. Подготовка образцовбыла проведена таким образом, чтобы все образцы были готовы к загрузке на гель в одно и тоже время. Образцы загружали на невосстанавливающие трис-глициновые 14% акриламидныегели, как есть, т.е.
без остановки окислительно-восстановительных реакций и без кипячения.Этот протокол также использовался с некоторыми модификациями, которые явно описаны втексте. Все гели были окрашены с использованием Coomassie R-250.Отнесение сигналов ЯМРОтнесение сигналов для атомов основной цепи проводилось с использованиемстандартного набора экспериментов тройного резонанса: HNCO, HNCA, HNCACB, HN(CA)CO,HN(CO)CA и HN(CO)CACB [82]. Все спектры были получены на спектрометре Bruker Avance39III с частотой 500 МГц, оборудованного датчиком TBI.
Результаты депонированыв базеданных BMRB под номером 19922.Релаксация, обусловленная корреляцией дипольного взаимодействия 1H-15Nианизотропии химического сдвига 15NИзмерения проводились с использованием импульсной последовательности Hall и др.[83]. Скорости поперечной релаксации , обусловленной кросс-корреляцией дипольдипольного взаимодействия и анизотропии химического сдвига, были получены из отношенияинтенсивностей высокопольной и низкопольной компонент дублета15N. Данные былизаписаны для задержек Δ равных 0, 11, 22, 32, 43, 54, 65, 75 , 86, 97 и 108 мс, затемпроинтегрированывnmrPipeфункциейnlinLS[84]иаппроксимированымоноэкспоненциальной функциией.
Задержка между сканами была равна 2 с.Эксперименты по H/D обменуРаствор, содержащий 20 мг RRM2 в фосфатном буфере, был разделен на четыре равныечасти и лиофилизирован. Белковый материал затем ресуспендировали для получения двухобразцов в 100% H2O и двух других образцов в 80% D2O / 20% H2O. Условия былистандартными для всех четырех образцов (без изотопной коррекции рН). Дополнительно 2 мМ15N-меченого N-ацетилглицина (NAG) было добавлено в качестве внутреннего стандарта.Экспериментпоокислению/восстановлениюначинаетсясресуспендированиялиофилизированного белкового материала, как описано выше (момент времени t = 0).
Реперныйспектр HSQC начинается в момент t = 25 мин (старт запланирован через Bruker Spooler) дляопределения объема пика для каждого спектрального сигнала. Затем в t = 55 мин аликвотаH2O2 была добавлена непосредственно в ЯМР ампулу, и образец был тщательно перемешан спомощью пипетки Пастера (концентрация H2O2 в образце 5 мМ).
В момент t = 1 ч 15 минначинается серия четырех последовательных спектров HSQC для получения зависящих отвремени данных интенсивностей пиков (). В момент t = 2 ч 55 мин, окисление обращаетсядобавлением аликвоты DTT в ЯМР ампулу (концентрация DTT в образце 25 мМ).
Наконец, приt = 3 ч 15 мин начинается серия из 55 последовательных спектров HSQC для расширения набораданных (). Тот же протокол используется для контрольных измерений, за исключением того,что добавляется аликвота H2O, а не H2O2.Все спектры были получены с использованием импульсной последовательности 1H,15NBEST-HSQC [85].
Каждый спектр был записан за 24 минуты и содержал 128 комплексных точек40в непрямом измерении. Записывалось 16 сканов на FID с использованием задержки наповторение 0,2 с. Данные были расширены линейным предсказанием в обоих измерениях,домножены на оконную функцию «синус квадрат» и дополнены нулями до преобразованияФурье. Интегрирование пиков выполнялось с использованием функции nlinLS на отдельныхдвумерных плоскостях (поскольку спектральные пики испытывали небольшие сдвиги вприсутствии H2O2 и DTT, мы не использовали autoFit для обработки данных в виде псевдо-3Dнабора данных) [84].
До анализа данные были нормированы, чтобы уравнять интенсивностьэталонных спектров для экспериментов с окислением/восстановлением и контрольнымиэкспериментами. В частности, постоянные нормировочные коэффициенты (+ )/2и (+ )/2были получены для каждого пика, а затем применены, соответственно, кпрофилям () и ().Динамическое рассеяние светаДанные ДРС были получены с использованием анализатора наночастиц Horiba SZ-100 сдлиной волны = 532 нм и углом рассеяния = 173°.
Каждая точка данных, соответствующаяавтокорреляционной функции второго порядка (2) (), была получена в течение 1 мин, затемследовала задержка 1 мин. Перед проведением измерений свежеприготовленный раствор RRM2центрифугировали в течение 10 мин на 10000 g для удаления примесей. Десятьпоследовательных точек были записаны для свежего образца в стандартных условиях. Послеэтого к образцу добавляли 5 мМ H2O2, тщательно перемешивали и данные ДРС записывалисьнепрерывно в течение 24 часов. В конце, добавляли 25 мМ DTT (или в другом эксперименте100 мМ DTT) непосредственно к окисленному образцу, и данные ДРС записывались еще 24часа.Экспериментальные данные были сначала преобразованы в соответствии с (1) () =√ 2 () − 1.
Как выяснилось, (1) () часто содержала часть с малой амплитудой и чрезвычайнодлинными временами затухания, связанную с остаточным загрязнением образца (частицыпыли, пузырьки воздуха и т.д.). В частности, данные для контрольного образца, который плохорассеивает свет из-за небольшого размера мономерного RRM2, воспроизводимо содержалитакие плато. Данные для полностью окисленного образца, который рассеивает свет намногоэффективнее из-за больших АЧ, не содержат видимых плато (вклад примесей в суммарнуюинтенсивность рассеяния становится в относительном выражении пренебрежимо малым).Наконец, для восстановленного образца, состоящего из смеси мономеров и меньших АЧ, платоприсутствуют, но их относительная интенсивность меньше, чем в контрольном образце.
Вкаждом скане, где наблюдается плато, их амплитуда колеблется от одного сканирования к41другому, что согласуется с флуктуациями числа частиц пыли, плавающей в кювете. Чтобыудалить эту нежелательную особенность, плато было аппроксимировано линейной моделью, азатем вычтено из (1) (). Полученная в результате функция без артефакта (1) () затем былааппроксимирована формулой выведенной Shibayama et al. для образца, содержащего два типасферических частиц (т.е.
мономеров RRM2 и агрегатов) [86]:(1) () = (1 exp(−1 2 ) + 2 exp(−2 2 ))(2.1)Здесь - инструментальный амплитудный фактор, - величина вектора рассеяния, =(4 /) (/2), - коэффициенты диффузии частиц, - амплитудные факторы, = 6 Φ2 ( ), - населенности двух видов частиц, Φ2 ( ) - соответствующие форм-факторы,Φ() = 3(sin() − cos())/()3.
Коэффициенты диффузии связаны с радиусами частиц через формулу Стокса-Эйнштейна: = /6(2.2)Показатель преломления = 1,3324 и вязкость буфера = 0,9223 cP были рассчитаны длязадачи с помощью программы Malvern Solvent builder (на основе данных из [87]).В случае контрольного образца ЯМР, в (1) () доминирует мономерный глобулярныйRRM2, что позволяет точно определить соответствующий коэффициент диффузии 1 . Чтобыопределить долю мономерных частиц в зависимости от воздействия H2O2/DDT, мыиспользовали эксперименты ЯМР.
Для образцов, которые были подвергнуты такой жеокислительно-восстановительной обработке, как и образец ДРС, была записана серия спектровHSQC. Как указано в тексте, спектры обычно содержат (i) набор резонансов, соответствующихсвернутыммономернымчастицамRRM2,и(ii)несколькоизолированныхпиков,соответствующих агрегатным частицам RRM2 (эти пики связаны с гибким C-концевым хвостомбелка). Интегрируя первый набор пиков, мы определяем долю мономера 1, которая колеблетсяот почти 100% в контрольном образце до 4,5% в полностью окисленном образце. Полученныезначения 1 затем подставляли в уравнение (2.1) для анализа данных ДРС. Данные HSQC былисопоставлены тем сканам ДРС, которые записывались во время серединной точки экспериментаHSQC.После подстановки 1 и 1 в уравнении (2.1) остается только один варьируемыйпараметр, а именно радиус агрегатной частицы 2 , который рассматривается как единственныйпараметр подгонки при анализе данных ДРС. Такой анализ с использованием уравнения (2.1)42дает значения 2 , которые малы по сравнению с длиной волны лазера, 2 < 1.
Это означает,что в очень хорошем приближении Φ(1 ) = Φ(2 ) = 1 [86].Измерение диффузии с помощью ЯМР с импульсным градиентом поляИзмерения диффузии с помощью стимулированного эха в импульсном градиенте поля(PFGSTE) были проведены с использованием импульсной последовательности из работы Choyи др.
[88]. Десять спектральных карт 1H,15N были записаны с амплитудой градиента g2 от 10до 50 Гc/см, длительностью g2 составлявшей δ/2 = 1 мс и временем диффузии Δ = 350 мс.Эксперименты были выполнены таким образом, чтобы минимизировать потенциальнуюсистематическую ошибку из-за прогрессирующего окисления (восстановления) образца вовремя измерений: = 10,0, 50,0, 14,4, 45,6, 18,9, 41,1, 23,3, 36,7, 27,8, 32,2 Гс/см. Градиенты g2имели сглаженную прямоугольную форму, и соответствующую эффективную силу градиента = 0.9 . Каждый спектр (64 х 1024 комплексных точки) был записан за 55 минут.Градиенты поля были откалиброваны в соответствии с инструкциями производителяспектрометра на стандарте «допированной воды».
Было выполнено три диффузионныхэксперимента.(i)Контрольныйэксперимент:экспериментподиффузии9чнасвежеприготовленном контрольном образце. (ii) Эксперимент на окисленном образце: 26,5 чинкубации с 5 мМ H2O2 с последующим 9-часовым диффузионным экспериментом наокисленном образце. (iii) Эксперимент на восстановленном образце: 43,5 ч инкубации с 5 мМH2O2 с последующей инкубацией 80 ч с 25 мМ DTT с последующим 9-часовым диффузионнымэкспериментом на исследуемом образце.
Спектральные пики, соответствующие мономерномуRRM2, были проинтегрированы и суммированы. Полученная суммарная интенсивность сигналабыла аппроксимирована модифицированным уравнением Стейскала-Таннера, описанным вссылке [88]:(2.3)2( ) = (0) exp (−2 2 (Δ − )),где = (/3) + (3/4) − ( ′ /4), а и ’ обозначают задержки между двумя кодирующими идвумя декодирующими импульсами градиента поля (1,360 и 1,364 мс, соответственно).Отдельный пик от АЧ был проинтегрирован и также интерпретирован с помощью уравнения(2.3).ТрипсинолизПроцессрасщепленияRRM2трипсиномнаблюдалсясиспользованиемтрис-трицинового гель-электрофореза [89]. Свежеприготовленный белковый материал выдерживался43в течение нескольких дней в фосфатном буфере с 25 мМ DTT. Перед проведением измеренийбуфер заменялся на 50 мМ Трис-HCl, pH 6,7, и затем были получены образцы с концентрациейбелка 1 мМ следующим образом. Контрольный образец (неокисленный, нерасщепленный):инкубировался в течение 2 ч с 25 мМ DTT (DTT удалялся ультрафильтрацией) хранился нальду в течение ночи; контрольный образец (окисленный, нерасщепленный): инкубировался втечение 2 ч с 5 мМ H2O2 (H2O2 удалялась ультрафильтрацией) хранился на льду в течение ночи;первый рабочий образец (неокисленный, расщепленный): инкубировался в течение 2 ч с 25 мМDTT (DTT удалялся ультрафильтрацией) обрабатывался трипсином в течение ночи; второйрабочий образец (окисленный, расщепленный): инкубировался в течение 2 ч с 5 мМ H2O2 (H2O2удалялась ультрафильтрацией) обрабатывался трипсином в течение ночи.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
