Диссертация (1150552), страница 13
Текст из файла (страница 13)
(продолжение).60Рисунок 2.8. (продолжение).61Рисунок 2.8. (продолжение).62Рисунок 2.8. (продолжение).Очень похожая картина наблюдалась также для мутанта RRM2 C198S. Этот мутантоказался значительно менее стабильным, чем дикий тип – например, остаток R208 показываетскорость обмена примерно в десять раз быстрее в C198S RRM2 по сравнению с диким типом(как видно из данных 2/2). Тем не менее, этот остаток все еще подходит на роль зондаH/D обмена по схеме описанной выше для дикого типа.
Результаты, представленные наРисунок 2.9, аналогичны данным дикого типа. Так как в C198S присутствует только одинцистеин, белок может образовывать только дисульфид-связанные димеры, но не олигомерывысшего порядка, мы приходим к выводу, что именно димеры, являются критическим этапомна пути к образованию агрегатных частиц, в то время как способность wt RRM2 к кросссшиванию является необязательной.Кроме того, сравнение ЯМР данных на Рисунок 2.9C с результатами ДСН-ПААГ наРисунок 2.2C показывает, что дисульфид-связанные димеры представляют собой относительнонебольшую долю белковых частиц в агрегатных частицах C198S (точнее, примерно одну третьпо массе). Эти АЧ в основном состоят из одноцепочечных частиц, которые являются63неупорядоченными и переплетаются с димерами.
В определенной мере, дисульфид-связанныедимеры можно рассматривать как зародыши, катализирующие образование АЧ.Рисунок 2.9. Данные H/D обмена для образца C198S RRM2, подвергнутого окислению ипоследующему восстановлению: объемы пиков для аминокислотного остатка R208 в сериипоследовательных спектров HSQC. (A) Контрольный (неокисленный) образец, буферныйраствор 100% H2O; (B) Контрольный образец (неокисленный), буферный раствор 80% D2O /20% H2O; (C) Окисленный образец, буферный раствор 100% H2O; (D) Окисленный образец,буферный раствор 80% D2O / 20% H2O. (E) Соотношения объемов пиков в D2O- и H2Oрастворителе, = 2/2(черные символы) и = 2/2(зеленые символы).Протокол эксперимента такой же, как описано в подписи к Рисунок 2.6 (см.
также 2.2.Материалы и методы).642.3.4. Характерный размер агрегатных частицХарактерные размеры для глобулярных мономеров и агрегатных частиц в образцахRRM2 были исследованы с помощью (i) динамического рассеяния света и (ii) измеренийдиффузии с помощью ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля. Дополнительнаяинформация была извлечена из интенсивности пиков в спектрах HSQC, которая даетинформацию о количестве глобулярных мономерных частиц. Данные ДРС были записаны внепрерывном режиме: сначала для свежеприготовленного контрольного образца (20 мин), затемв присутствии 5 мМ H2O2 (24 ч), затем после добавления 25 мМ DTT (24 ч).
Корреляционныефункции (1) () были извлечены из экспериментальных данных способом, описанным вразделе 2.2. Материалы и методы. Примеры данных ДРС для контрольного, окисленного ивосстановленного образцов показаны на Рисунок 2.10А. Медленный спад (1) () в окисленномобразце отражает наличие медленно диффундирующих АЧ (синяя кривая); наоборот, быстроезатухание (1) () в контрольном и восстановленном образцах говорит о преобладании быстродиффундирующих мономеров (красные и зеленые кривые).Рисунок 2.10. (A) Автокорреляционные функции ДРС для контрольного, окисленного, ивосстановленногообразца(красные,синиеизеленыесимволы,соответственно).Экспериментальные данные от сканов длиной 1 мин, полученных при t = 0, 24 ч, и 48 ч,соответственно.
После аппроксимации уравнением (2.1), результаты были нормированы спомощью подогнанного значения изначальной интенсивности ; (B) Зависимость сигнала ЯМРот силы градиента , измеренная для глобулярного мономерного RRM2 в контрольном и65восстановленном образцах (красные и зеленые символы, соответственно), а также дляагрегатныхчастицRRM2вполностьюокисленномобразце(синиесимволы).Экспериментальный протокол и последовательность действий описаны в разделе 2.2.Материалы и методы.
После аппроксимации уравнением (2.3), результаты были нормированы спомощью подогнанного значения амплитуды сигнала (0).Аналогичные данные также могут быть получены с помощью эксперимента PFGSTE наоснове HSQC, см. Рисунок 2.10B. По существу, этот эксперимент измеряет спад интенсивностиспектральных сигналов за счет трансляционной диффузии молекулы или агрегатной частицы вградиенте внешнего магнитного поля.
В случае контрольного и восстановленного образцов мыиспользовали набор спектральных пиков от глобулярного мономерного RRM2. В случаеполностью окисленного образца, мы сфокусировались на сильном пике N265, которыйпринадлежит АЧ и, таким образом, позволяет нам изучать трансляционную диффузиюагрегатных частиц. Медленный спад сигнала N265 объясняется медленной диффузией АЧ(синяя кривая на Рисунок 2.10В); с другой стороны, быстрый спад сигналов глобулярногомономерного RRM2 свидетельствует о быстрой диффузии (красная и зеленая кривые).Мы начали анализ данных путем аппроксимации данных ЯМР эксперимента PFGSTE спомощью соответствующей версии уравнения Стейскала-Таннера, уравнение (2.3).
Дляконтрольногообразца,аппроксимированныйкоэффициентдиффузииглобулярногомономерного RRM2, = 1,38 ± 0,01 · 10-10 м2/с, что соответствует гидродинамическомурадиусу = 17,1 ± 0,1 Å, см уравнение (2.2). Эти результаты находится в полном согласии срезультатами ДРС: = 1,40 ± 0,08 · 10-10 м2/с, а = 16,9 ± 0,9 Å. Также полезно сравнитьэкспериментальные данные с результатами численного моделирования.
С этой целью мыизвлекли серию кадров из 1 мкс МД траектории глобулярного мономерного RRM2 ииспользовали их в качестве входных данных для программы HYDRONMR [113]. Предсказанноезначение коэффициента диффузии = 1,39 ± 0,01 · 10-10 м2/с, оказывается почти идентичнымэкспериментальным результатам. Мы использовали ту же серию кадров МД для вычисленияобъема [114] и эффективного сухого радиуса глобулярного RRM2, который получился равным13,51 ± 0,02 Å; разница между сухим радиусом и гидродинамическим радиусом объясняетсягидратацией белка [115]. Наконец, коэффициент диффузии мономерных частиц, измеренный спомощью эксперимента PFGSTE в восстановленном образце (т.е.
образце, которая прошелчерез цикл окисление-восстановление) составляет 1,45 0,04 · 10-10 м2/с. Это значениесогласуется с данными для контрольного образца в пределах двух стандартных отклонений;66такой результат подтверждает, что обработка DTT восстанавливает RRM2 к своейпервоначальной глобулярной форме.В качестве следующего шага, мы проанализировали данные ДРС и ЯМР, которые былизаписаны в непрерывном режиме в ходе окисления образца и последующего восстановления. Вслучае ДРС, набор данных, охватывает 48 часов и состоит из 1254 сканов.
В случае ЯМР,эквивалентный набор данных состоит из 35 спектров HSQC записанных подряд. При анализеэтих данных мы сделали два предположения: (i) меняющуюся долю глобулярных мономерныхчастиц, , можно определить по интенсивности соответствующих пиков HSQC и (ii)коэффициент диффузии мономерных частиц остается таким же, как в контрольном образце (см.обсуждения выше). Используя эти предположения, мы аппроксимировали всю сериюкривых (1) () уравнением (2.1), где значения 1 , а также 1 = были зафиксированы насоответствующих значениях для глобулярных мономерных частиц RRM2.
Следовательно, ваппроксимации участвовало только два подгоночных параметра: коэффициент диффузииагрегатных частиц, 2 = и общий масштабирующий коэффициент . Пример наилучшейаппроксимации кривых, полученных таким образом, можно видеть на Рисунок 2.10А (синие изеленыекривые).Проведеннаяинтерпретацияданныхпозволятизвлечьвременныезависимости а также . Последние могут быть легко преобразованы с помощью уравнения(2) в гидродинамический радиус агрегатных частиц . Полученные результаты резюмированына Рисунок 2.11.На Рисунок 2.11 очевидна тенденция: окисление образца приводит к прогрессирующейпотере глобулярных мономеров и сопутствующему формированию АЧ (синие кривые), тогдакак последующее восстановление переводит большую часть образца в мономерное состояние,хотя некоторые из более мелких АЧ выдерживают обработку DTT (красные кривые).
Двааспекта заслуживают отдельных комментариев. Первый касается образца RRM2 после 24 часовокисления. В этом образце массовая доля глобулярных мономеров равна всего лишь 4,5%.Учитывая, что эффективность рассеяния света зависит от радиуса частицы, вклад мономеров в(1) () оказывается очень маленьким. Вклад мономерного компонента пренебрежимо мал посравнению с таковым от агрегатных частиц, 1 /2 = 0.0013, см. уравнение (2.1).
Такимобразом, мы приходим к выводу, что в случае полностью окисленного образца RRM2корреляционные функции ДРС могут быть аппроксимированы с помощью одной экспонентыбез потери точности. В дальнейшем мы используем это наблюдение.67Рисунок 2.11. Характерные параметры образца RRM2 в процессе окисления (синие символы) ипоследующего восстановления (красные символы). (A) Доля глобулярных мономерных частицRRM2 по данным HSQC.
Каждый символ на графике расположен по оси времени в среднейточке соответствующего эксперимента HSQC. (В) Эффективный гидродинамический радиусагрегатных частиц по данным ДРС. Мы проанализировали скан ДРС синхронизированный ссерединой HSQC эксперимента. Кроме того, мы проанализировали два предыдущих и двапоследующих скана ДРС, а затем определили среднее значение (окно выборки ДРС составляет10 мин). Аппроксимация кривых ДРС проводилась с использованием значений , показанныхна панели (А), и = 1,40 · 10-10 м2/с. Данные на панели (B), синяя кривая, могут бытьэкстраполированы на момент времени 31 ч, чтобы облегчить сравнение с экспериментомPFGSTE.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
