Диссертация (1150552), страница 17
Текст из файла (страница 17)
В то время как термическая стабильностьдимера действительно может быть понижена [129], димер, тем не менее, остается хорошосвернутым. Причина склонности к агрегации дисульфид-связанных димеров должна бытьдругой.2.4. Заключение по главе 2В этой главе проведено детальное исследование процессов происходящих с белками вусловиях окислительного стресса, а именно разупорядочивания, агрегации и повышеннойуязвимости к протеолизу. Для исследования различных состояний белка, а также процессовперехода между этими состояниями были разработаны и применены методы на основе ЯМРэкспериментов1H,15N HSQC для наблюдения H/D обмена, измерения спин-решеточнойрелаксации, а также релаксации обусловленной кросс-корреляцией диполь-дипольноговзаимодействия с анизотропией химического сдвига, методы реконструкции функциираспределения частиц по размерам по данным коэффициентов диффузии ЯМР и ДРС, а такженаблюдение и количественная характеризация триптических пептидов с помощью ЯМРспектроскопии 1H, 15N HSQC.
Развитие этих методов ЯМР позволило извлечь достаточно много83информации о состояниях системы, недоступных для изучения другими методами, и сделатьниже следующие выводы.Окисление тиолов цистеина в домене RRM2 невропатологического белка TDP-43 имееттри основных последствия: димеризация (олигомеризация) через дисульфидные связи,разворачивание, и формирование агрегатных частиц. Точная последовательность этих событийи их причинно-следственное отношение априори не известны. Ряд различных сценариев можетбыть предложен для объяснения экспериментальных наблюдений. Например, можнопредположить, что образование не нативных дисульфидных мостиков C244-C244 вызываетнемедленныйколлапсэлектростатическихдоменнойвзаимодействийструктурыилипостерическихпричинестолкновенийдестабилизирующихнамеждоменноминтерфейсе. Этот сценарий обсуждался в разделе 2.3.7 и считается маловероятным.
Еще одингипотетический сценарий предполагает «разворачивание при связывании» или «разворачиваниепри агрегации». В этом случае предполагается, что дисульфид-связанные димеры стабильнысами по себе, но разворачиваются при образовании комплекса с другим димером илиагрегатной частицей. Эта гипотеза обсуждается в разделе 2.3.6, а также отклоняется на основеимеющихся экспериментальных данных.На данный момент мы видим только один механизм, который согласуется с собраннымиданными и может убедительно объяснить все наши наблюдения. В частности, мы считаем, чтообразование не нативных дисульфидных мостиков нарушает способность домена RRM2 крефолдингу.
Каждый свернутый белок должен в общем случае рассматриваться какдинамическое равновесие между свернутым состоянием (доминирующим) и частично илиполностью развернутым состоянием (минорным). Это представление вытекает непосредственноиз измерений термодинамической стабильности белка [130]. Даже самые стабильныеглобулярные белки испытывают большие возмущения структуры, которые, по существу,равнозначнычастичномуразворачиванию.Этобылонепосредственноподтвержденоизмерениями H/D обмена, дисульфидным захватом и другими методами [131, 132]. Небольшиеглобулярные домены, такие, как RRM2, как правило, могут пережить такие возмущения: ониобладают способностью к рефолдингу без посторонней помощи.
Однако, это не так длядисульфид-связанного димера RRM2, который не может должным образом осуществитьрефолдинг. Ситуация усугубляется тем, что димер состоит из двух идентичных единиц и,следовательно, взаимодействия, которые стабилизируют нативную конформацию RRM2, такжемогут стабилизировать междоменное состояние с неправильной сверткой (“domain swapping”)[133].
В более общем смысле, способность сворачиваться надлежащим образом и избегатьнеправильного фолдинга - это особенность белков, которая в значительной степени была84приобретена путем эволюции. Мы не ожидаем наблюдать ее в димере с не нативнымимежмолекулярными дисульфидными связями. Потеря этой ценной особенности означает, чтобольшие тепловые флуктуации могут привести димер RRM2 к разворачиванию илинеправильному сворачиванию.Разупорядоченные димеры RRM2 служат в качестве затравки для агрегатных частиц.Рост АЧ дополнительно контролируются дисульфидным связыванием, хотя и не требуетполного сшивания (как показано для мутанта RRM2 с одним цистеином).
Обмен тиолдисульфид приводит к перетасовке дисульфидных связей в АЧ и диссоциации некоторыхпептидных цепей. Как следствие, агрегатные частицы содержат значительную долюразупорядоченных одноцепочечных RRM2. Когда эти пептиды отсоединяются от АЧ, ониповторно сворачиваются, образуя глобулярные домены (таким образом, устанавливаетсядинамический обмен между свернутой конформацией и АЧ).Агрегатные частицы, наблюдаемые в наших экспериментах, имеют небольшие размеры,и, как правило, состоят из нескольких пептидных цепей. Структурно они одновременно исильно разупорядочены, и сильно неоднородны (отсутствует быстрое динамическое усреднениеконформаций).
Неоднородность частично является следствием различных форм дисульфидныхсвязей, а частично результатом наличия нескольких конформаций, возникающих принеправильном сворачивании в системе, составленной из множества копий одной и той жепептидной цепи. Значительная часть АЧ оказалась устойчивой к обработке восстанавливающимагентом: эти маленькие неправильно свернутые частицы остаются стабильными даже в течениенескольких дней после того, как дисульфидные связи были восстановлены до тиолов.Не нативные дисульфидные мостики, формируемые между молекулами белков поддействием окислительного стресса (i) уменьшают способность этих белков к рефолдингу и (ii)увеличивают их склонность к мисфолдингу.
Следовательно, баланс смещается в сторонуразупорядоченных и агрегированных конформаций белка. Эти частицы удаляются из клетки спомощью систем деградации белка, но некоторые белки и/или их протеолитические фрагментыизбегают протеолиза и образуют белковые тельца, такие как амилоидные фибриллы иликлубки. Например, нейронные включения в случае TDP-43. В настоящее время ведутсяисследования общности этого механизма для всех белков, содержащих боковые цепи цистеина,экспонированные в растворитель, а не только для одного из доменов TDP-43, рассматриваемогов этой работе.85Глава 3.
Температурная зависимость спиновой релаксации 15N нативноразупорядоченных белковПоскольку различные ковалентные модификации аминокислотных остатков могутприводитькдестабилизацииструктурыиразупорядочиваниюбелка,тоизучениенеструктурированных динамичных разупорядоченных белков само по себе представляетважную проблему. Для установления иерархии типов молекулярного движения основной цепиразупорядоченных белков нами изучены процессы ЯМР релаксации атомов15N, а такжеразработаны новые алгоритмы анализа траекторий МД для расчетов ЯМР параметров.Нативноразупорядоченныебелки(IDP)структурноявляютсяоченьгибкимимолекулами.
Их динамика отличается от динамики свернутых белков. Для полученияпредставления о механизме и соответствующем масштабе времени движений, вовлеченных вдинамику IDP, был исследован N-концевой участок гистона H4 длиной 26 аминокислот. Наядрах 15N были измерены скорости релаксации для пептида при трех температурах (5°C, 25°C,55°C). Кроме этого, при этих температурах были записаны траектории молекулярной динамики(МД) длиной 1-2 мкс для этого пептида, с использованием силового поля Amber ff14SB-ILDN ичетырехразличныхмоделейводы(SPC/E,TIP3P,TIP4P/EW,TIP4P-D).Сравнениекомпьютерного моделирования с экспериментальными данными показало, что MD склассическими моделями воды генерирует компактные структуры и, таким образом, показываетзавышенные значения скоростей релаксации.
Модель воды TIP4P-D, предложенная Piana и др.[134] полуколичественно воспроизводит температурную зависимость данных ЯМР и позволяетдетально изучить вклады от различных мод молекулярного движения. Мы проанализироваликооперативность движений, обуславливающих релаксацию, и обнаружили, что они являютсялокальными и не распространяются далее чем на 5-6 аминокислот в полностьюразупорядоченной части пептида.
Это локальное движение внутри разупорядоченного пептидаможет быть описано скачками двугранных углов и колебаниями, происходящими на разныхвременных масштабах.3.1. Проблема классификации и изучения типов молекулярного движения IDP спомощью ЯМР и МДНативно-развернутые белки представляют собой белки без четко определеннойвторичной и третичной структуры, что позволяет им быть очень гибкими.
Это свойствопозволяет им связываться с различными мишенями, а также претерпевать фолдинг при86связывании [28]. IDP составляют около 25% всех белковых последовательностей [26, 27] — этообширное многообразие протеинов, несущих многие важные функции, такие как регулированиеклеточных процессов и передача сигналов [29]. В IDP конформационная изменчивость являетсяосновной характеристикой, которая сохраняется в процессе эволюции [30]. Множестводоступных конформаций IDP в некоторых случаях включает патогенные формы. IDP являютсяосновной составной частью белковых включений при болезнях Альцгеймера, Паркинсона идругих нейродегенеративных заболеваниях [32, 33].Знание динамики IDP необходимо для лучшего понимания функций IDP принормальном гомеостазе и патологиях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
