Диссертация (1150552), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Ионы были смоделированы с помощью параметров от Jung иCheatham [162]. Численное интегрирование уравнений движения выполнялось алгоритмомleapfrog с шагом 2 фс. Связи с участием атомов водорода были ограничены алгоритмом SHAKE[163]. Для расчетов электростатических взаимодействий дальнего действия использовалсяметод Эвальда. Нековалентные взаимодействия рассчитывались на расстоянии до 10,5 Å, какрекомендовано Piana и соавторами [164]. Минимизация энергии проводилась в три этапа сиспользованием постоянного объема и уменьшения гармонических ограничений на тяжелыхатомах (k = 500 ккал/моль-1Å-2, 100 ккал/моль-1Å-2, 10 ккал/моль-1Å-2). После минимизации былпроведен нагрев системы при постоянном объеме в течение 1 пс с шагом 1 фс. Последнимэтапом в подготовке системы было уравновешивание при постоянном давлении 1 бар в течение1 нс.
Уравновешивание давления осуществлялось с помощью баростата Берендсена [165] свременем релаксации давления τ = 2 пс. Термостат Ланжевена использовался с частотойстолкновения γln = 2,0 пс-1. Чистовая симуляция проводилась в ансамбле NPT в течение 2 мкс.Моделирование проводили при трех температурах: 278 К (5°С), 298 К (25°С) и 328 К (55°C) длявсех моделей воды. Суммарная длина траекторий составила 24 мкс. Модель воды TIP4P-D былаимплементирована в Amber с использованием программы ParmEd из пакета AmperTools и с91параметрами, приведенными в Piana и др.
[134]. Мы проверили сходимость симуляций путемвычисления параметров порядка S2, которые оказались очень маленькими (<0,004) для всехаминокислотных остатков и температур.Чтобы рассчитать скорости релаксации ЯМР 1 и , автокорреляционные функциивектора NH () были извлечены из траектории с шагом в 1 пс:∞ ()1= ∫ (3 cos2 () − 1)(3 cos2 ( + ) − 1)4(3.1)−∞ представляет собой направляющий угол вектора, заданного связью HN, в моментвремени .Ранее были выявлены различные режимы движения, которые затем были использованыпри расчете скоростей релаксации ЯМР по траекториям МД [142, 166]. Мы будем сравниватьнаши результаты с динамическими режимами, предложенными в этих работах.
Поэтому здесьмы определим общую номенклатуру режимов движения, которые будут обсуждаться. (1)Субпикосекундное движение, приводящее к резкому падению от ( = 0) к ( = 1 пс),называется режимом сверхбыстрых колебаний. (2) Движение в режиме нескольких десятковпикосекунд пс называется быстрым движением. (3) В масштабе единиц наносекунд происходитдвижение промежуточной шкалы времени. (4) Движение в масштабе времени несколькихдесятков наносекунд, которое было идентифицировано в предыдущих работах [141, 142], будетименоваться медленным движением.Сверхбыстрое движение является слишком быстрым, чтобы способствовать релаксацииЯМР, поскольку его вклад в спектральную плотность на частотах ЯМР незначителен.
По этойпричине мы пренебрегли первой точкой корреляционной функции ( = 0) и анализировалиданные начиная с точки ( = 1 пс) = 0 .Корреляционныефункциибылиаппроксимированыдвумяэкспоненциальными () = 0 ((1 − 2 ) exp(−/1 ) + 2 exp(−/2 ))(3.2)функциями с весами 2 и 1 = (1 − 2 ).Аппроксимация выполнялась в два этапа.
Сначала был проведен поиск по сеткепостоянных времени 1 и 2 с постоянными амплитудами 1 = 2 = 0,5. Затем параметры,дающие минимальное отклонение от данных, были взяты в качестве исходных значений дляаппроксимации уравнением (3.2) с тремя свободными параметрами 2 , 1 и 2 .92Мы также проверили трех-экспоненциальную аппроксимацию, включающую быстрые,промежуточные и медленные режимы движения, с функцией с пятью свободнымипараметрами: () = 0 ((1 − 2 − 3 ) exp(−/1 ) + 2 exp(−/2 ) + 3 exp(−/3 ))(3.3)Однако эта функция не приводит к устойчивым аппроксимациям, и поэтому неиспользовалась для дальнейшего анализа.На больших временах симуляции, когда значение корреляционной функции упало почтидо нуля ( () < 0,05), корреляционная функция начинает колебаться около нуля.
Здесьначинаются статистические флуктуации, и их включение в анализ не улучшает аппроксимацию,а наоборот добавляет шум. Поэтому значения () < 0,05 были исключены изаппроксимаций. Такой подход, на первый взгляд, увеличивает вес быстро затухающихкомпонент корреляционных функций и влечет за собой риск упустить возможные вклады врелаксацию от медленных мод движения. Но в реальности, мы сравнили влияние наличия этогоограничения на рассчитанные из аппроксимаций скорости релаксации и обнаружили, что онозначительно меньше 3%.ПараметрырелаксацииЯМРрассчитывалисьизкорреляционныхфункцийсиспользованием стандартного набора параметров [167]. Сходимость моделирования былапроверена путем вычисления параметров ЯМР отдельно из двух половин траектории. Скоростирелаксации для обеих половин отлично согласуются.Для характеризации компактности пептида в ходе траектории с шагом времени 100 псбыл рассчитан радиус гирации для тяжелых атомов пептида согласно уравнению (3.4).2∑=1(| − | )√ =(3.4)Здесь - центр масс белка, - координаты -го тяжелого атома.
Мы также оцениликоличество водородных связей с использованием стандартных критериев: длина < 0,3 нм и угол< 20°.Псевдотраекция без колебаний двугранных углов была рассчитана по следующейметодике. Мы проанализировали двугранные углы и для траектории и создали две картыРамачандрана, для глицина и для других аминокислотных остатков (Рисунок S8). В этих картахРамачандана районы с возможными комбинациями / были определены как кластеры. В93каждом кластере для пары углов / существует точка с максимальной заселенностью.
Углыв этих точках были определены как опорные углы, таким образом мы определили одну паруопорных углов кластера в каждом кластере. Теперь мы проанализировали каждую структурутраектории и идентифицировали для каждого аминокислотного остатка, в каком кластере пары / он находится на текущем шаге. Затем мы создали список углов для каждогоаминокислотного остатка, в который записываются опорные углы кластера вместо реальныхуглов / . Эта процедура устраняет для аминокислотных остатков колебания углов вокругопорного угла, но сохраняет прыжки между различными кластерами. С этим списком углов мысоздали новую искусственную структуру для полиглициновой цепи.
Все углы былиустановлены на 180°. Таким образом, была создана новая структура с 25 аминокислотнымиостатками для каждого шага исходной траектории. Затем пептид в псевдо траектории былвыровнен по одной пептидной плоскости для всех кадров траектории. Эта траектория с однойфиксированной плоскостью использовалась для вычисления корреляционных функцийвекторов NH.
Из корреляционной функции рассчитанной из этой псевдо траекториивычислялись параметры ЯМР.3.3. Результаты и обсуждение3.3.1. Скорости ЯМР релаксации 15N для хвоста гистона H4В текущей работе мы исследуем хвост гистона H4 длиной 26 аминокислотных остатков.Последовательность этого пептида показана на Рисунок 3.1а. Хвост H4 состоит из двух частей,с различающимися свойствами: первые 15 аминокислот богаты глицином, а вторая частьсодержит несколько заряженных аминокислот с массивными боковыми цепями, но не глицин.Данные ЯМР релаксации были записаны на приборе 500 МГц при трех температурах.Были получены скорость спин-решеточной релаксации 1 и скорость релаксации ,обусловленнаяпоперечнойкросс-корреляциейвзаимодействий.
Спектр1H,15N HSQC,измеренный при 25°C, показан на Рисунок 3.2 вместе с отнесением наблюдаемых сигналов.Несмотря на то, что спектр HSQC показывает слабую дисперсию химических сдвигов 1H,характерную для IDP [168-170], можно выделить несколько изолированных пиков. Для оценкискоростей релаксации были выбраны только те пики, которые не перекрываются с соседнимипиками, и которые были однозначно отнесены. При измерении скоростей релаксации при 25°С9418 пиков били хорошо разрешены. Число пиков было меньше при всех других температурах и визмерениях .Рисунок 3.1. (а) Последовательность для хвоста гистона H4, который использовался в данномисследовании.
Последовательность можно разделить на две части: первые 15 аминокислотбогаты глицином, вторая часть содержит более заряженные и громоздкие боковые цепи.(b-e) Сравнение экспериментальных и расчетных скоростей ЯМР релаксации при 25°C (расчетыс различными моделями воды). (b) Экспериментальная скорость ЯМР релаксации 1 , (c)расчетная скорость ЯМР релаксации 1 , (d) экспериментальная скорость релаксации , (e)расчетная скорость релаксации .(e-h) Нормализованное распределение радиусов гирации для хвоста H4 в ходе моделирования сразличными моделями воды.95Рисунок 3.2. 1H,15N HSQC для хвоста H4, состоящего из 26 аминокислотных остатков,записанный при 25°C.
Сигналы обозначены в соответствии с результатами стандартныхизмерений отнесения. Все пики H4, кроме двух, могут быть отнесены однозначно при 25°С.Скорости релаксации при 25°C показаны как функция номера остатка на Рисунок 3.1b и3.1d для 1 и , соответственно. Два наблюдения могут быть сделаны при анализе измененияскоростей релаксации вдоль последовательности. (1) Скорости релаксации показывают хорошоизвестный профиль, зависящий от последовательности [136, 171, 172]: несколько первых ипоследнихаминокислотимеютменееограниченную,болеебыструюдинамикуи,следовательно, имеют меньшие скорости релаксации. (2) Первая часть последовательности,которая богата глицином, как показано на Рисунок 3.1, обладает более быстрой динамикой, чемвторая часть молекулы, которая содержит аминокислотные остатки с более крупными96боковыми цепями.
Также данные согласуются с зависимостью скорости релаксации от типааминокислоты, описанной Schwarzinger и др. [135]. Кроме того, такую тенденциюподтверждают результаты Zhou и др. [152], которые утверждают, что первые 15 аминокислотхвоста H4 являются нативно разупорядоченными, а аминокислоты 16-22 образуют такназываемый щелочной локус, который взаимодействует с нуклеосомой.Было выполнено моделирование MD с использованием моделей воды SPC/E, TIP3P,TIP4P-EW и TIP4P-D. Параметры ЯМР релаксации были рассчитаны, как это описано в секции3.2 Материалы и методы. Полученные из МД скорости релаксации приведены для всехсимуляций при 25°C на Рисунок 3.1с и 3.1e. Здесь мы подчеркиваем, что скорости релаксациибыли рассчитаны из МД-моделирования без какой-либо взаимосвязи с экспериментальнымиданными.Моделирование воспроизводит правильный порядок значений скоростей релаксации.Моделирование с трехточечной моделью воды SPC/E и четырехточечной моделью воды TIP4PEW дает почти одинаковые скорости релаксации.
Моделирование с моделью воды TIP3P даетзначительно более короткие времена релаксации. Наилучшее количественное согласие междурасчетными скоростями релаксации (Рисунок 3.1b,d) и измеренными в экспериментескоростями релаксации (Рисунок 3.1c,e) получено для моделирования с новой моделью водыTIP4P-D.Времена релаксации, полученные при моделировании с моделью воды TIP4P-D,примерно в два раза меньше, чем в симуляциях SPC/E и TIP4P-EW. Это связано с увеличениемвклада дисперсионного взаимодействия, которое вызывает более сильное взаимодействиемежду водой и пептидом. В результате вероятность внутримолекулярного взаимодействияпептида уменьшается и, следовательно, образуется менее компактная структура.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
