Диссертация (1150552), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Во-вторых, рассмотрение гидратной оболочкиаминокислот как суперпозиции гидратных оболочек отдельных молекулярных групп иквантово-химическиерасчетыводногоокружениясделаливозможнымопределениехарактерных времен переориентационного движения молекул воды в этих гидратныхоболочках. В-третьих, измерения ЯМР релаксации15N в нативно разупорядоченных белкахбыли интерпретированы совместно с данными моделирования МД, что позволило выявитьосновные моды молекулярного движения, ответственные за процесс ЯМР релаксации вподобных системах.Методы ЯМР, а также ряд других вспомогательных биофизических методов, былиприменены для изучения систем, включающих в себя аминокислоты и белки.
В каждой из трехрассмотренных систем было произведено всестороннее исследование свойств систем, чтопозволило достигнуть глубокого понимания процессов и физических явлений. В частности,можно привести следующие основные результаты и выводы.1. Обнаружено, что при низких концентрациях аминокислот в D2O скорости ЯМРрелаксации ядер 2H воды зависят линейно от числа метиленовых групп вструктуре аминокислоты. На основе обнаруженной аддитивности вкладов врелаксацию ядер растворителя построена модель водного окружения ωаминокислот. Квантово-химические расчеты и экспериментальные данныесогласованно показывают, что гидратное окружение группы CH2 содержит 7молекул воды.
Времена корреляции вращательного движения молекул водывблизи гидрофобной метиленовой группы в 1,5-2 раза длиннее, чем у объемнойводы, в температурном диапазоне от 2 до 55˚C. Средняя вращательнаяподвижность молекул воды в гидратных оболочках гидрофильных групп ωаминокислот составляет 0,8 ÷ 1,0 от значений времени корреляции для объемнойводы.1172. Показано, что обработка белков с помощью H2O2, моделирующая окислительныйстресс, приводит к образованию межмолекулярных дисульфидных мостиковчерез аминокислоту цистеин на поверхности. Что, в свою очередь, приводит кмасштабным структурным изменениям.
Это становится исходной точкой дляпроцессов агрегации и дестабилизации структуры, что повышает уязвимостьбелка к протеолитическому расщеплению. На основе данных ЯМР по H/D обменуи рефолдингу белковой цепи, а также компьютерного моделирования МД,показало, что дисульфид-связанные агрегаты (димеры и олигомеры) перешедшиев развернутое состояние под действием большой тепловой флуктуации, обладаютнизкой способностью к рефолдингу. Это приводит к постепенному переходубелка от нативного состояния к разупорядоченному.3.
Разработан новый ЯМР-эксперимент на базе 1H,15N HSQC для определенияскоростей H/D обмена в агрегатных частицах белков, формирующихся приокислительном стрессе. Данные по H/D обмену, отслеженному с помощью этогометода на изотопно-меченных образцах белка RRM2, в согласии с другимибиофизическими методами показывают, что (i) дисульфид-связанные димерыутрачивают способность длительное время сохранять стабильную структуру испособность к правильному рефолдингу и по этой причине могут служитьзародышем для агрегации белков, (ii) формируемые агрегатные частицывключают в себя не только димеры и олигомеры, но и мономеры, (iii) междуфракцией растворимых мономеров и агрегированным белком происходит обменза счет обменной реакции тиол-дисульфид.4. Разработана новая методика для реконструирования функции распределениябелковых агрегатных частиц по размерам, основанная на совместном анализеданных измерений диффузии с помощью ЯМР с импульсным градиентоммагнитного поля и данных динамического рассеяния света.
Ее апробация напримере домена RRM2 белка TDP-43 показала, что размеры агрегатных частицраспределены по экспоненциальному закону.5. Температурная зависимость скоростей спиновой релаксации ядеркросс-релаксацию,обусловленнуюкросс-корреляциеймежду15N, включаядипольнымвзаимодействием и взаимодействием с анизотропией хим. сдвига, для нативноразупорядоченных белков на примере N-концевого хвоста гистона H4 показала,что динамические процессы в этом белке имеют характерные времена корреляцииот 100 пс до 1 нс при комнатной температуре.
Моделирование методоммолекулярной динамики скоростей ЯМР релаксации показало, что модель воды118TIP4P-D обеспечивает наилучшее согласие расчетов с экспериментом. На основетраектории МД с водой TIP4P-D выявлены моды движения, которые вносятнаибольшийвклад в ЯМР релаксацию15N: скачкообразные изменениядвугранных углов основной цепи белка вызывают релаксацию, как в гибкой, так ив более структурированной части разупорядоченных белков, однако для гибкойчасти существенный вклад составляют колебания этих углов, чего ненаблюдается для структурированной части.В качестве рекомендаций по дальнейшей разработке темы диссертации стоит отметитьследующие моменты.1.
Методы определения времен ЯМР релаксации ядер растворителя в подструктурахс быстрым обменом могут быть применены к системам подобным тем, которыебыли рассмотрены, например, к карбоновым кислотам, ионным жидкостям икороткоцепочечным поверхностно-активным веществам. Логичным развитиемпредложенного подхода будет точный учет медленно обменивающихся сайтовпутем введения соответствующих членов в уравнения Блоха-Мак Конелла.2. Специально адаптированный ЯМР эксперимент по H/D обмену, основанный наимпульсной последовательности1H,15N HSQC, ограничен по временномуразрешению.
Этот недостаток можно было бы компенсировать использованиемболее высокопольных спектрометров и чувствительных криодатчиков (чтопозволило бы сократить время накопления одного спектра) либо применениемновыхметодикбыстройзаписиспектров,такихкакнеравномерноесемплирование (“non-uniform sampling”) или ультрабыстрый ЯМР (“ultrafastNMR”).119БлагодарностиВ первую очередь автор выражает искреннюю благодарность научному руководителюНиколаю Руслановичу Скрынникову за помощь в работе над диссертацией, внимательноеотношение ко всем аспектам научного исследования, выполненного во время обучения васпирантуре, постоянный интерес к результатам экспериментов и за создание плодотворной идружелюбной атмосферы в лаборатории биомолекулярного ЯМР СПБГУ.Также автор благодарит Владимира Ивановича Чижика за обсуждение критическихвопросов диссертации, ценные замечания и конструктивную критику.Алексея Валерьевича Донца хочется поблагодарить за обсуждения ключевых моментовисследований гидратации аминокислот, трепетное отношение к научным проблемам инеоценимую поддержку.Хочется выразить благодарность сотрудникам лаборатории биомолекулярного ЯМРСПбГУ.
Ивану Сергеевичу Подкорытову за продолжительные дискуссии и всестороннююпомощьворганизацииработы.СергеюАлександровичу Измайлову запомощьсмоделированием МД, компьютерными расчетами и поддержание работы вычислительныхресурсов лаборатории. Керстин Кемпф за важный вклад в экспериментальную и расчетнуюработу по изучению особенностей ЯМР релаксации разупорядоченных белков. ДмитриюАлександровичу Лузику за помощь в приготовлении образцов.Автор благодарит Научный парк СПбГУ, в частности ресурсные центры: «Магнитнорезонансные методы исследования»; «Центр диагностики функциональных материалов длямедицины, фармакологии и наноэлектроники»; «Развитие молекулярных и клеточныхтехнологий»; «Вычислительный центр»; «Оптические и лазерные методы исследованиявещества»;«Методыкалориметрическиеанализаметодысоставаисследования»;вещества»;«Термогравиметрические«Криогенныйотдел»;и«Прикладанаяаэродинамика».
Хочется отдельно поблагодарить сотрудника РЦ «МРМИ» МихаилаАндреевича Вовка за помощь в выполнении ряда экспериментов по данной работе.Наконец, автор выражает благодарность Рабдано Олегу Борисовичу и НикитеОлеговичу, Прокониным Ларисе Александровне, Татьяне Николаевне иАлександруФилипповичу за искреннюю и энергичную поддержку во время выполнения диссертации.120Список сокращений6ACA – 6-аминокарбоновая кислотаbALA – β-аланинBEST-HSQC - band-selective excitation short transient heteronuclear single-quantum correlationC198S – мутация цистеин на серин в позиции 198C244S – мутация цистеин на серин в позиции 244db-RRM2 – дисульфид-связанные димеры RRM2DTT – дитиотреитолGABA – γ-аминомаслянная кислотаGLY – глицинGRD – богатый глицином доменHSQC – heteronuclear single-quantum correlationIDP – нативно разупорядоченные белкиNAG – N-ацетил глицинND – N-терминальный доменNES – сигнал ядерного экспортаNLS – сигнал ядерной локализацииPFGSTE – стимулированное эхо в импульсном градиенте поляPPII – полипропилен IIRMSD – root mean square deviationROHF – restricted open shell Hartree-FockRRM2 – второй РНК-распознающий доменTDP-43 - transactive response DNA binding protein 43wt RRM2 – дикий тип RRM2АЧ – агрегатные частицыГЭП – градиент электрического поляДМСО – диметилсульфоксид121ДРС – динамическое рассеяние светаДСН-ПААГ – додецилсульфат натрия – полиакриламидный гельМД – молекулярная динамикаФРР – функции радиального распределенияЯМР – ядерный магнитный резонанс122Список литературы1.
Consortium I. H. G. S. Initial sequencing and analysis of the human genome // Nature. ‒2001. ‒ T. 409, № 6822. ‒ C. 860.2. Consortium I. H. G. S. Finishing the euchromatic sequence of the human genome // Nature.‒ 2004. ‒ T. 431, № 7011. ‒ C. 931.3. Tait M.
D., Suggett A., Franks F., Ablett S., Quickenden P. A. Hydration ofMonosaccharides: A Study by Dielectric and Nuclear Magnetic Relaxation // Journal of SolutionChemistry. ‒ 1972. ‒ T. 1, № 2. ‒ C. 131-151.4. Ishihara Y., Okouchi S., Uedaira H. Dynamics of hydration of alcohols and diols in aqueoussolutions // Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions. ‒ 1997. ‒ T. 93, № 18. ‒ C. 33373342.5. Okouchi S., Moto T., Ishihara Y., Numajiri H., Uedaira H. Hydration of amines, diamines,polyamines and amides studied by NMR // Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
