Диссертация (1150552), страница 18
Текст из файла (страница 18)
В глобулярных белках динамика может быть описаналокальными движениями отдельных частей и глобальными движениями белка целиком. Однакограница между этими двумя типами движения становится все более размытой, по мереуменьшения структурированности белка и увеличения его подвижности [31].Измерения ЯМР релаксации являются универсальным методом для исследованиядинамики белков. ЯМР релаксация 15N позволяет изучить функции спектральной плотности дляспиновой системы амидный протон-азот и предоставляет информацию о динамике основнойцепи белка.
Измерение различных типов скоростей релаксации дает информацию о динамике вразных временных шкалах. Продольная скорость релаксации 1 чувствительна к быстройдинамике в диапазоне пс-нс. Для этих же целей можно измерять скорость поперечнойрелаксации ,обусловленнуюкросс-корреляциейдиполь-дипольнойрелаксацииирелаксации по причине анизотропии химического сдвига. Измерение скорости выгоднее,чем более часто используемая скорость спин-спиновой релаксации 2 , по той причине, что онаисключает вклад химического обмена, который может внести систематическую ошибку вданные 2 .Schwarzinger и др. ранее показали измерениями скоростей релаксации для IDP, чтоскорость релаксации часто коррелирует с размером боковых цепей аминокислот или другимиограничивающими движение факторамми [135].
Кроме этого, было установлено, чтоаминокислотные остатки более подвижны на концах IDP, чем в центре [136].Недавно Абызов и др. исследовали зависимости скоростей ЯМР релаксации оттемпературы и магнитного поля для С-концевого домена (NT) нуклеопротеина вируса Сендай,и обнаружили три различных моды движения в пептиде: (1) сверхбыстрое движение, котороебыло интерпретировано как либрации пептидной плоскости, имеющие время корреляциипорядка 50 пс; (2) внутренняя динамика на промежуточном масштабе времени в несколько87наносекунд; (3) вклад с медленной динамикой и масштабом времени порядка несколькихдесятков наносекунд. В этих работах исследование происхождения движений на уровнеструктуры молекул не производилось.Чтобы получить более глубокое представление о механизмах динамики IDP, которыеспособствуют спиновой релаксации ЯМР, в настоящей работе мы используем комплексныйподход,включающийизмеренияспиновойрелаксацииЯМРиМД-моделирования.Моделирование МД как метод исследования динамики имеет преимущество в доступностиполной траектории.
Это позволяет изучить и понять вклады различных движений на атомномуровне. Долгое время моделирование МД не могло полностью захватить достаточноеколичество конформационного пространства для воспроизведения динамики IDP. Длясопоставления результатов МД с данными ЯМР ранее использовались различные подходы: (i)псевдопотенциал для направления моделирования таким образом, чтобы воспроизводитьэкспериментальные значения [137-139]; (ii) выбор части конформаций таких, чтобысоответствовать экспериментальным данным наилучшим образом [140, 141]; или (iii)моделирование при высоких температурах с масштабированием временной оси [142].
В нашейработе мы используем неограниченное моделирование при разных температурах, и неприбегаемкиспользованиюэкспериментальныхданныхдляуправленияпроцессоммоделирования.Исследованный пептид, N-терминальный хвост гистона Н4, - мал (26 аминокислот),поэтому большая часть конформационного пространства может быть захвачена в траекториидлиной 2 мкс. В частности, в траектории такой длины хорошо захватывается динамика схарактерными временами порядка пикосекунд и наносекунд, отвечающая за релаксациюядерной намагниченности.Для правильного воспроизведения динамики пептида важное значение имеетвоспроизведение молекул воды. Ранее было показано, что несмотря на хорошую выборкуконформационого пространства при симуляциях в вакууме [143], в них не удается правильновоспроизвести тип движений [142]. Для явных молекул воды можно выбрать несколькомоделей.
В большинстве МД для белков разработчиками силовых полей рекомендуются трехточечные модели воды, например, SPC/E, TIP3P или четырех-точечные модели, напримерTIP4P-EW. Выбор модели воды подразумевает компромисс между скоростью расчетов иточностью моделирования свойств воды.Стандартные модели воды были протестированы для моделирования IDP.
Былообнаружено, что они приводят к чрезмерно компактным структурам для IDP и развернутых88глобулярных белков [134, 144, 145]. Причина такого поведения объясняется переоценкойвзаимодействия белок-белок [144, 146], что, возможно, произошло, из-за заниженногодисперсионного взаимодействия в воде [134, 145].
Piana и др. поэтому недавно предложилиновую модель воды под названием TIP4P-D, которая имеет более сильные дисперсионныевзаимодействия и воспроизводит менее компактные структуры белка [134]. Недавно эта модельбыла протестирована группой Henriques, которая подтвердила результат, что TIP4P-D подходитдля воспроизведения динамики IDP [147].Из моделирования МД параметры ЯМР релаксации могут быть рассчитаны всоответствии со стандартными протоколами [148-150].Мы измерили скорости спин-решеточной релаксации 1 и релаксации, обусловленнойкросс-корреляцией дипольного взаимодействия и взаимодействия анизотропией химическогосдвига, при температурах 5, 25, 55°С в пептиде из 26 аминокислот из N-конечного хвостагистона Н4, а также моделировали тот же пептид с самым новым силовым полем Amber ff14SB[33, 151], в водном окружении с четырьмя различными моделями воды: SPC / E, TIP3P, TIP4PEW, TIP4P-D.Исследованный пептид, хвост гистона H4, является частью частицы нуклеосомы, спомощь которой организуется структура ДНК в клеточном ядре.
Предполагается, чтополикатионные гибкие хвосты гистонов способствуют образованию структур хроматина болеевысокого порядка [152, 153].3.2. Материалы и методыЭкспрессия и очистка хвоста Н4N-концевой хвост гистона Н4 длиной 26 аминокислот (последовательность на Рисунок 1)был клонирован в вектор рЕТ-32b(+), в котором содержатся гистидиновый и тиоредоксиновыйтеги.15N меченый белок был экспрессирован в E.coli Rosetta при 37°С в соответствии спротоколом, опубликованным Marlet и др. [154], следующим образом: клетки E.coli Rosettaвыращивали в среде SOB при 300 об/мин до достижения оптической плотности 1,2.
Затемклетки центрифугировали в течение 10 мин при 8000g и ресуспендировали в минимальнойсреде М9. Клетки инкубировались в течение 40 минут для адаптации к новым условиям, затем кним добавлялся15N-меченый хлорид аммония. Через 35 минут индуцировалась экспрессия спомощью изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида.
Клетки собирались через 12 часов. Они89были лизированы с помощью криомельницы, затем три раза обработаны ультразвуком на льдув течение 1 мин и 1 мин охлаждения после обработки. Экспрессированную конструкциюочищали с использованием никель-аффинной хроматографии. Затем тиоредоксиновый игистидиновый теги отщеплялись тромбином.
Затем пептид очищался с помощью гельфильтрационной хроматографии, где хвост H4 хорошо отделялся от тэгов. Из-за небольшогоразмера хвоста H4 замена буфера – это очень трудоемкий процесс. Чтобы избежать этого шага,гель-фильтрационная хроматография проводилась в чистой воде. Затем образец быллиофилизирован и перерастворен в ацетатном буфере с рН 4,0. Низкий рН был выбран длязамедления обмена амидных протонов с протонами растворителя. Коаксиальная вставка в ЯМРампулу WG-5BL от Wilmad, заполненная 70 мкл D2O, была использована для измерениясигнала lock.ЯМР спектроскопияСтандартныйнаборэкспериментов(HSQC,HNCA,HN(CO)CA,HNCACB,NH(CO)CACB, HNCO, HN(CA)CO) был записан при 25°C для отнесения сигналов в спектре1H,15N HSQC. Спектры были проанализированы в программе CARA. Наше отнесениесогласуется с отнесением первых 15 остатков этого пептида, опубликованным Zhou и др. [152].Измерения ЯМР релаксации проводили с использованием спектрометра Bruker AVANCE500 МГц, оснащенного датчиком тройного резонанса.
Спектры1H,15N HSQC, скоростирелаксации 1 и были измерены при трех температурах (5, 25, 55°C). Температура былаоткалибрована по спектру от стандартного образца метанола. Температурная стабильностьпептида была протестирована путем записи спектров 1H,15N HSQC от образца до и после егонагревания до 55°C. Существенных изменений в спектре не наблюдалось.Для измерения скорости продольной релаксации 1 использовалась модифицированнаяверсия импульсной последовательности с двумя блоками INEPT для записи спектров 1H,15NHSQC.
Значения были измерены с помощью импульсной последовательности из работ [155,156]. Все измерения были выполнены с использованием 8 различных времен задержки нарелаксацию. Эффект нагрева образца РЧ полем оценивался путем расчетов скоростейрелаксации с использованием только первых 5 значений времен задержки. Из сравненияскоростей релаксации, полученных из полного набора данных, нагрева не было обнаружено.Все спектры были обработаны с использованием программы nmrPipe [84].Молекулярная динамика90Моделирование MD выполнялось с помощью пакета AMBER 14 и силового поляAMBER ff14SB [151] для пептида и четырех различных моделей воды: TIP3P [157] , SPC/E[158], TIP4P-EW [159] и TIP4P-D [134].
Все данные были записаны с использованием рабочихстанций в Лаборатории биомолекулярного ЯМР в Санкт-Петербургском государственномуниверситете.Расчеты были проведены для аминокислот 2-26 N-концевого хвоста гистона H4. Первыйглицин отсутствовал в моделируемой последовательности. Эта небольшая разница междумоделируемой последовательностью и изученной экспериментально влияет только нарезультаты только первых 2 или 3 остатков и, следовательно, является несущественной.Исходная конформация белка была выбрана следующим образом.
Прежде всего, 2000разупорядоченных структур были сгенерированы с помощью программы “unfolded” [160], иScrwrl4 [161]. Энергия каждой структуры была минимизирована за 1000 шагов алгоритмомградиентного спуска. Затем была рассчитана энергия и получено распределение энергии дляансамбля. Из наиболее вероятных структур одна структура была выбрана случайным образом вкачестве исходной. Моделирование проводили при рН 4,0. Состояния протонированияаминокислот были заданы программой PROpKa [90, 91].Ячейка в форме усеченного октаэдра была заполнена водой с минимальным расстоянием15 Å от белка (около 8300 молекул воды) до периодических граничных условий. Заряд системыбыл нейтрализован 8 ионами Cl-.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
