Диссертация (1150552), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Значение отображается горизонтальной пунктирной линией для сравнения.Эксперимент, показанный на этом графике, также был повторен с использованием 100 мМ DTT(см. Рисунок 2.12).Второе замечание касается образца RRM2 после 24 часов окисления с последующимвосстановлением в течение 24 ч. Данные на Рисунок 2.11 показывают, что около 40% от массыбелка в этом образце остается в агрегированном состоянии.
В то же время ДСН-ПААГ гельуказывает, что в таком восстановленном образце нет дисульфидных связей, см. Рисунок 2.13.Это также было подтверждено дополнительной серии измерений ДРС. Это демонстрирует, чторезультат эксперимента не зависит от того, обрабатывается ли образец 25 или 100 мМ DTT, см.Рисунок 2.12. Следовательно, оставшиеся агрегатные частицы не требуют наличиядисульфидных мостиков, чтобы оставаться стабильными. Они представляют собой небольшиекластеры из развернутых пептидных цепей, которые удерживаются нековалентными68взаимодействиями.
Эти АЧ можно рассматривать как кинетически заблокированные состояния,которые не возвращаются в глобулярную форму (термодинамический выгодную), по крайнеймере, в течение нескольких дней.Рисунок 2.12. Эффективный размер агрегатных частиц RRM2 в процессе окисления (синиесимволы) и последующего восстановления (красные символы). Экспериментальный протокол иинтерпретация данных аналогичны Рисунок 2.11, за исключением того, что в этой серииизмерений образец восстанавливался с помощью 100 мМ DTT.Рисунок 2.13.
Невосстанавливающий ДСН-ПААГ из образца RRM2, подвергнутого 31часовому окислению 5 мМ H2O2 и последующее 31-часовое восстановление с помощью 25 мМDTT. Интенсивности полос в геле были оцифрованы с использованием программы GelAnalyzer,69а затем тщательно интегрированы с использованием специально написанных скриптов; область,содержащая слабо разрешенные полосы от дисульфидных n-меров высокого порядка (n > 5)были интегрированы и включены в нормализация данных, показанных на Рисунок 2.14.Наконец, мы рассмотрим результаты PFGSTE эксперимента на окисленном образце.Эксперимент по измерению диффузии с помощью ЯМР является относительно длительным. Онтребует 9 часов.
В принципе, это может привести к определенной систематической ошибке изза прогрессирующего окисления образца в процессе измерений. Однако, данные были записаныдля полностью окисленного образца в тот момент, когда изменения во времени , а также малы и почти линейны, см. Рисунок 2.11. Кроме того, эксперимент был выполнен такимобразом, чтобы усреднить подобные эффекты (см. 2.2. Материалы и методы). Данные PFGSTEотражают состояние образца в средней точке эксперимента, что соответствует в нашем случаемоменту времени t = 31 ч после начала окисления. Для этой точки времени ЯМР экспериментдает коэффициент диффузии агрегатных частиц = 0,55 ± 0,02 · 10-10 м2/с. С другой стороны,значение на основе ДРС в тот же момент времени составляет 0,40 0,01 · 10-10 м2/с.Очевидно, что различие между двумя результатами выходит за пределы допустимойпогрешности.
Такое положение можно сравнить с измерениями, выполненными наконтрольном (неокисленном) образце, где результаты ЯМР и ДРС были в превосходномсогласии.Что может быть причиной этого несоответствия? По-видимому, АЧ не могутрассматриваться как монодисперсная система (стоит заметить, что АЧ включают в себядисульфид-связанные олигомеры разного порядка, см. Рисунок 2.2). Скорее всего, эти АЧдолжны описываться с помощью определенной функции распределения по размеру. Вреальности, и эффективно захватывают два различных момента этой функциираспределения.
Как будет описано в следующем разделе, соответствующий сигнал ЯМРувеличивается с радиусом агрегатной частицы как 3 , в то время как сигнал ДРС увеличиваетсякак 6 . Другими словами, эксперимент ДРС переоценивает большие частицы по сравнению сЯМР. Поэтому не удивительно, что ниже, чем , так как он переоценивает медленнодиффундирующие АЧ. В следующем разделе мы используем эту ситуацию для того, чтобыразработать простую модель функции распределения агрегатных частиц по размерам.702.3.5. Функция распределения по размеру агрегатных частиц RRM2Здесь мы сосредоточимся на полностью окисленном образце RRM2, стремясь построитьфункцию распределения частиц по размерам для агрегатных частиц, содержащихся в этомобразце. Вкратце, предлагается модельная функция плотности вероятности (), и параметры() варьируются таким образом, чтобы воспроизвести и (которые можнорассматривать как два различных функционала от функции распределения по размерам).Предположим, что АЧ могут быть описаны в виде шара с постоянной плотностью.
Вэтом случае уравнение (2.1) может быть легко обобщено для образца, содержащегополидисперсные агрегатные частицы:∞(1) () = ̃ ∫ () 6 exp(− 2 ) (2.4)Коэффициент диффузии связан с радиусом в соответствии с уравнением (2) и ̃является новой нормировочной константой. Функция плотности вероятности () и уравнение(2.4) относятся исключительно к агрегатным частицам, но не к глобулярному мономерномуRRM2. Как обсуждалось выше, массовая доля глобулярного мономерного RRM2 в полностьюокисленном образце составляет 4,5% и его вкладом в экспериментально измеряемую (1) () вэтой ситуации можно пренебречь. Нижний предел интегрирования в уравнении (2.4) равенрадиусу дисульфид-связанного димера RRM2, который является самой маленькой агрегатнойчастицей.Аналогично можно рассчитать кривую ( ) для эксперимента PFGSTE, используяуравнение (2.3) в качестве отправной точки.
В общем случае не так просто определить вклад отчастиц с радиусом в наблюдаемый сигнал ЯМР. Действительно, можно ожидать, что тяжелыечастицы характеризуются высокими скоростями спиновой релаксации и, следовательно, даютслабый сигнал ЯМР. Однако, это не так для нашего конкретного эксперимента, в которомдетектируется только сигнал N265'. Этот пик возникает от аминокислотного остатка на концегибкого С-концевого хвоста, который всегда сольватирован и высокодинамичен независимо отразмера АЧ, в которую он входит (см. Рисунок 2.1). Таким образом, вклад от частиц с радиусом в наблюдаемый сигнал просто пропорционален количеству пептидных цепей, содержащихся водной частице, или, другими словами, пропорционален 3 .
Следовательно, уравнение (2.3)можно переписать следующим образом:71∞2( ) = ̃(0) ∫ () 3 exp (−2 2 (Δ − )) (2.5)Можно заметить внутреннее сходство в структуре уравнений (2.4) и (2.5), которые, темне менее, отличаются весовыми коэффициентами: 6 и 3 . В связи с этим стоит также отметить,что и могут быть аппроксимированы в этой ситуации, как пятый и второй моменты() (см., например, в ссылке [116]).
Однако мы обнаружили, что такое приближение нескольконеточно по сравнению с подходом, описанным ниже.Определив эти результаты, мы предпринимаем следующую процедуру. Для заданнойфункции плотности вероятности () мы симулируем данные (1) () и ( ) с помощьюуравнений (2.4) и (2.5). Таким образом, мы воспроизводим экспериментальный протокол, т.е.используем одни и те же задержки и силы градиентов, которые использовались в нашихэкспериментальных измерениях, см. Рисунок 2.10. В дальнейшем мы аппроксимируемсимулированные данные (1) () и ( ) для воспроизведения экспериментальных данных(как уже было указано, вкладом глобулярных мономерных частиц, можно пренебречь).
Такимобразом, мы извлекаем ,и ,и далее формируем функционал 2 = (,−22,) + (,− ,) . Путем варьирования параметров () функционал 2 можетбыть сведен к минимуму. Таким образом получается модельная функция распределения поразмерам, которая согласуется с экспериментальными данными ДРС и ЯМР.Одна из возможных реализаций () – экспоненциальная зависимость:() = −1 exp(−( − )/),( ≥ )(2.6)Это модель с двумя параметрами, которая зависит от минимального размера агрегатнойчастицы и масштабирующего коэффициента , который отражает ширину распределения.Модель описанная уравнением (2.6) является эмпирической, хотя несколько похожа нафункцию распределения ~ exp(− 3 ), возникающую у Флори для процесса ступенчатойполимеризации [117, 118] и в решении уравнения Смолуховского для столкновительнойагрегации [119].
В нашем исследовании использование уравнения (6) было мотивированоминималистичным характером этой модели, и, более конкретно, данными ДСН-ПААГ, Рисунок2.13. В принципе, следует рассматривать () как суперпозицию нескольких распределений (), где () представляет собой распределение размера подмножества АЧ, состоящих из ппептидных цепей, АЧ(п).
Тем не менее, взяв во внимание неупорядоченный и гетерогенныйхарактер АЧ, распределения должны быть достаточно широкими, таким образом их72суперпозиция должна быть гладкой функцией (аналогичной функции, заданной уравнением(2.6)).Процедура аппроксимации с использованием уравнения (2.6) была проведена способом,описанным выше. Для этой модели возможно точное решение, в результате чего 2 = 0 (это невсегда так для других двупараметрических моделей). Полученная кривая () показана наРисунок 2.14А вместе с серией кривых из сопутствующего анализа Монте-Карло.Аппроксимированное значение составляет 28,6 Å. Учитывая, что минимальная агрегатнаячастица в этой системе должна быть дисульфид-связанным димером, то значение можетбыть использовано для оценки минимального уровня гидратации димера.
Результат – 2.68грамм воды на грамм белка. Это на порядок выше, чем типичный уровень гидратации длясвернутых белков, 0,3 г/г, и в пределах диапазона для частично и нативно неупорядоченныхбелков, 1-10 г/г [120]. Этот результат согласуется с нашим пониманием о дисульфид-связанныхдимерах RRM2, как о разупорядоченных белках.Разумно предположить, что минимальная степень гидратации является одинаковой длядимеров и для больших агрегатных частиц. Используя это предположение, функция плотностивероятности может быть разделена на полосы, соответствующие АЧ(п) (например, перваяполоса соответствует агрегированным частицам с n = 2 и уровнем гидратации в диапазоне от2,68 до 4,38 г/г, вторая полоса соответствует n = 3 и гидратации диапазоне от 2,68 до 3,81 г/г, ит.д.). Интегрируя () по соответствующим полосам мы получим функцию распределенияΛ(), которая покажет населенности АЧ(п).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
