Диссертация (1150552), страница 12
Текст из файла (страница 12)
RRM2 в агрегатных частицах разупорядоченЭксперимент по H/D обмену амидных протонов является мощным инструментом дляисследования стабильности и свернутости белка [111]. Как правило, в этом экспериментелиофилизированный белковый материал растворяется в D2O и затем записывается серияспектров HSQC один за одним, чтобы отследить прогрессирующую потерю интенсивностипиков из-за замещения протонов на дейтроны.
В рассматриваемой системе, однако, ситуациятребует более сложного эксперимента. Как уже было описано, агрегированные частицы невидны в спектрах ЯМР. Таким образом, мы сначала проводим H/D обмен в окисленномобразце, содержащем АЧ, и после этого восстанавливаем образец с помощью DTT такимобразом, чтобы преобразовать АЧ (частично) в глобулярные мономерные частицы. Последниеподдаются спектральному наблюдению и тем самым делают возможным косвенное наблюдениепроцесса поглощения дейтерия агрегатными частицами. Аналогичные стратегии широкоиспользуются в исследованиях фибрилл и телец включений.
Как правило, образцы сначалавыдерживают в D2O, а затем конвертируют в мономерную форму путем растворения в ДМСО,что позволяет в результате записать данные с помощью рутинной HSQC спектроскопии [112].В нашем случае, эксперимент по Н/D обмену был проведен с использованием четырехобразцов RRM2. Первая пара образцов – один растворен в 100% H2O, другой в 80% D2O / 20%H2O – используется в качестве контроля. Эти образцы не подвергались окислению: вместоH2O2, в них было введено небольшое количество буферного раствора. Данные от этих двухобразцов характеризуют структурную стабильность глобулярной конформации RRM2, и,следовательно, предоставляют удобную точку отсчета для того, чтобы судить о стабильностиАЧ. Результаты проиллюстрированы на остатке F231 в домене RRM2.
Профиль на Рисунок2.6A был получен для образца в 100% H2O; он содержит данные 60 последовательнозаписанных спектров HSQC (см. 2.2. Материалы и методы). Как и следовало ожидать, профильявляется по существу плоским, кроме небольшого перепада интенсивности в точке 3 ч 30 мин(после того, как 25 мМ DTT были добавлены в ЯМР ампулу, в результате чего образец былразбавлен на 2,5%). Аналогичный профиль, показанный на Рисунок 4В, был получен от образца54в 80% D2O / 20% H2O.
Он иллюстрирует постепенное замещение амидных протонов в F231 надейтроны. Этот процесс оказывается относительно медленным, что ожидаемо для остатка F231,потому что он находится в β3 тяже вблизи середины поверхности β-листа и, следовательно, егоамидная группа хорошо защищена от обмена с растворителем.Рисунок 2.6. Данные H/D обмена для образца wt RRM2 подвергнутого окислению с55последующим восстановлением: объемы пика остатка F231 в серии последовательнозаписанных спектров HSQC . (A) Контроль (неокисленный) образец, 100% H 2O буферныйраствор. (B) Контроль (неокисленный) образец, 80% D2O / 20% H2O буферный раствор.
(C)Окисленный образец, 100% H2O буферный раствор. (D) Окисленный образец , 80% D2O / 20%H2O буферный раствор. Окисление образца заключалось в обработке 5 мМ H 2O2 в течении 2ч, от t = 55 мин до t = 2 ч 55 мин, и прерывалось обработкой 25 мМ DTT. Другиеэкспериментальные детали, в том числе нормализация пиков, описаны в разделе 2.2.Материалы и методы. (Е) Отношения объемов пиков от образцов в буферах, основанных наD2O и H2O, = 2/2(черные символы) и = 2/2(зеленые символы).Другая пара образцов используется непосредственно для исследования влиянияокисления цистеина. Эти два образца были подвергнуты 2 ч обработке с помощью 5 мМ H2O2(от t = 55 мин до t = 2 ч 55 мин, прерывается путем обработки с помощью DTT).
Зеленыйпрофиль показанный на Рисунок 2.6C иллюстрирует данные для образца в 100% H2O.Начальная крутая потеря интенсивности происходит из-за трансформации глобулярногомономерногоRRM2вненаблюдаемыеАЧ.Последующеевосстановлениеотражаетвозвращение RRM2 к его глобулярной мономерной форме. Восстановление явно неполное – какуже упоминалось, некоторые из АЧ оказываются устойчивыми к обработке DTT.
Зеленыйпрофиль на Рисунок 2.6D демонстрирует эффект окисления в буферном растворе с 80% D2O /20% H2O. Чрезвычайно резкий начальный спад имеет две очевидных причины – уменьшениедоли глобулярного мономерного RRM2 в окисленном образце и проникновение дейтерия востальные глобулярные домены. На самом деле, существует дополнительные факторы, которыемы обсудим ниже. Обработка DTT при t = 2 ч 55 казалось бы приводит к небольшомувосстановлению интенсивности, но эффект оказывается очень слабовыраженным.
Этопроисходит, потому что цепи RRM2 в АЧ являются «насыщенными» дейтерием (учитываясостав растворителя, содержание дейтерия в амидных участках должно быть около 80%).Следовательно, рефолдинг RRM2 после обработки DTT приводит к очень малому увеличениюнаблюдаемого сигнала. Наконец, после t = 5 ч интенсивность сигнала продолжает медленноснижаться из-за дальнейшего проникновения дейтронов в глобулярную структуру RRM2. Вконце концов, величина сигнала, как ожидалось, достигнет плато приблизительно на уровне0,16, что соответствует содержанию H2O в растворителе, 20%, и доле мономерных частиц ввосстановленном образце, 80%.Вышесказанное предлагает одно важное заключение. В частности, данные показывают,что агрегатные частицы быстро обменивают амидные протоны на дейтерий.
Это согласуется с56неупорядоченной природой полипептидных цепей, составляющих АЧ, как показано на Рисунок2.1.Для дальнейшего расширенного анализа данных H/D обмена, мы рассчитали отношениепрофилей на Рисунок 2.6D и 2.6C = 2/2. Результат представлен зеленой кривой наРисунок 2.6E. В первом приближении, эта процедура удаляет эффект потери/усиленияинтенсивности за счет переходов глобулярного RRM2 в АЧ при окислении образца и обратногоперехода после восстановления. Остается только эффект увеличения содержания дейтерия вглобулярном мономерном RRM2.
Для сравнения, мы также рассчитали отношение профилей,показанных на Рисунок 2.6B и 2.6А для контрольных образцов, = 2/2. Результатпредставлен черной кривой на Рисунок 2.6E.В дальнейшем мы сосредоточимся на данных на Рисунок 2.6E. Во время окисленияобразца, со второй по пятую точку данных, мы видим, что глобулярные домены RRM2относительно быстро поглощают дейтерий (зеленая кривая). Скорость поглощения дейтерия втечение этого интервала времени заметно выше, чем в контрольном образце (черная кривая).Учитывая, что обе кривых относятся к одинаковым глобулярным частицам возникает вопрос:как объяснить это наблюдение? Мы предполагаем, что существует динамический обмен междуглобулярными частицами RRM2 и АЧ, что приводит к увеличению поглощения дейтерияглобулярным RRM2 (по сравнению с неокисленным контрольным образцом).
Механизм этогообмена описан ниже.Восстановление образца с помощью DTT дополнительно увеличивает содержаниедейтерия в глобулярных доменах RRM2 и, следовательно, снижает значение отношенияобъемов (переход от 5 к 6 точке данных на зеленой кривой). Действительно, в течение этогоинтервала времени большая часть АЧ преобразуется в глобулярную мономерную форму.Поскольку пептидные цепи в АЧ разупорядочены и в обменивающихся сайтах насыщеныдейтерием, то это приводит к увеличению уровня дейтерирования в ансамбле глобулярногоRRM2.
Наконец, начиная с 6-й точки данных мы наблюдаем дальнейшее постепенное снижениев , из-за продолжения обмена амидных протонов на дейтроны в глобулярных доменахRRM2. В восстановленном образце этот процесс происходит медленно, так же как вконтрольном образце (ср. Рисунок 2.6E, зеленую и черную кривые).
В конце концов, как таки должны сходиться к плато на уровне приблизительно 0,2, что соответствует содержаниюH2O в растворителе.Те же самые выводы, которые были продемонстрированы с помощью спектральногопика F231, Рисунок 2.6, могут быть распространены на другие пики, см. Рисунок 2.7 и 2.8. На57Рисунок 2.7 показаны четыре типичных примера, начиная от медленно обменивающегосяостатка L207 до быстро обменивающегося остатка C244. Быстро обменивающиеся остаткистановятся моментально насыщенными дейтерием и, следовательно, не могут дать никакойполезной информации. Все другие сайты указывают на одинаковый паттерн: (i) пептидныецепи внутри АЧ разупорядочены и (ii) существует динамический обмен между АЧ иглобулярной формой RRM2.Рисунок 2.7.
Данные H/D обмена для образца wt RRM2, подвергнутому окислению споследующим восстановлением: отношение объемов пиков = 2/2и =2/2(черные и зеленые символы, соответственно) для остатков L207, T233, F210 и C244.58Рисунок 2.8. Данные H/D обмена для образца wt RRM2, подвергшегося окислению споследующим восстановлением: отношения объемов пиков = 2/2и =2/2(черные и синие символы, соответсвенно). Данные приведены на этом рисунке длявсех аминокислотных остатков, имеющих достаточно интенсивные и хорошо разрешенныеспектральные пики.59Рисунок 2.8.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
