Диссертация (1150552), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Этот образец, в основном, содержит мономеры, хотя по массе порядка 19%белка остается в агрегированной форме. Его спектр HSQC подобен спектру контрольногообразца, хотя имеет более низкую интенсивность пиков, см. Рисунок 2.16E. Особое значениедля нас спектр представляет спектр, записанный после обработки трипсином, Рисунок 2.16F.Как можно видеть из спектральной карты, множество пиков от глобулярного мономерногоRRM2 остается неизменным. В то же время, мы наблюдаем ряд слабых пиков,соответствующих триптическим пептидам, которые появляются в тех же позициях, что и вспектре на Рисунок 2.16D (отмечены красными стрелками). Интенсивность этих слабых пиковнаходится на уровне 19% по отношению к доминирующим пикам мономера.
Поэтому логичнопредположить, что они представляют собой продукты протеолитического расщепления АЧ,которые остаются в восстановленном образце.Особый интерес представляет сравнение спектров на Рисунок 2.16D и 2.16F. Вокисленном образце мономерный глобулярный RRM2 существует в состоянии динамическогообмена с агрегатными частицами. Когда RRM2 захватывается в АЧ, он подвергаетсяразворачиванию и затем расщепляется трипсином, будучи частью агрегатной частицы. Врезультате, количество глобулярного мономерного RRM2 уменьшается.
В восстановленномобразце, этого не происходит. Несмотря на то, что в образце присутствует значительная доляАЧ, глобулярный RRM2 не захватывается в агрегатные частицы. Следовательно, количествоглобулярного RRM2 остается неизменным, несмотря на то, что агрегированные частицыподвергаются протеолизу. Эти наблюдения имеют прямые последствия для объяснениямеханизма формирования АЧ.Теоретически, можно предложить два различных механизма для захвата RRM2 в АЧ.Первый механизм может быть описан как «разворачивание при связывании» (“unfolding uponbinding”) или «разворачивание при агрегации» (“unfolding upon aggregation”) [123, 124].
Онпредполагает, что глобулярный домен RRM2 переходит в разупорядоченное состояние примеханическом контакте с АЧ и затем становится вплетен в агрегатную частицу (впоследствиион может сформировать дисульфидную связь с другими пептидными цепями внутри АЧ, аможет и не сформировать). В целом, можно ожидать обратимости этого процесса, котораяпозволяет существовать динамическому обмену между глобулярной и агрегированной формойRRM2.79Второймеханизмподразумеваетобразованиедисульфидногомостикамеждуглобулярным RRM2 и агрегатной частицей.
Особое значение в этом контексте приобретаетобмен тиол-дисульфид [125-127]. Дисульфидная связь в АЧ разрывается, и затем глобулярныйдомен RRM2 становится ковалентно присоединен к агрегатной частице. В дальнейшем, этотдомен становится развернутым (как обсуждается ниже, не нативная дисульфидная связьухудшает способность белков к рефолдингу).
Такая же реакция может привести к частичномуили полному разрыву ковалентных связей между одной из пептидных цепей и АЧ. В концеконцов, эта цепь может диссоциировать от агрегатной частицы, свернуться и таким образомпревратиться обратно в глобулярный мономерный RRM2.Можно, на самом деле, предвидеть различные варианты этого механизма. Например,RRM2 может сшиться с агрегатной частицей с помощью реакции с участием пары свободныхтиолов; впоследствии, реакция обмена тиол-дисульфид может иметь место внутри АЧ, чтоприведет к отторжению одной мономерной цепи от частицы. В любом случае, процессдинамического обмена между глобулярным и агрегированным состояниями критически зависитот дисульфидных связей во всех подобных сценариях.Наш эксперимент по трипсинолизу и, в частности, результаты отраженные на Рисунок2.16D и 2.16E, весомо свидетельствуют в пользу второго механизма, но не первого.Действительно, обмен между глобулярной формой RRM2 и неупорядоченными агрегатнымичастицами имеет место в окисленном образце, но не в восстановленном образце (хотяпоследний также содержит значительное количество АЧ).
Поэтому дисульфидные связи нетолько вызывают образование агрегатных частиц, но и контролируют их рост. Первыймеханизм «разворачивание при связывании» должен играть лишь второстепенную роль, есливообще сколько-нибудь важную.2.3.7. Дисульфид-связанные димеры RRM2 стабильны в длинных симуляциях МДПревращение глобулярного мономерного RRM2 в дисульфид-связанные АЧ включает всебя переход от структурного порядка к разупорядочиванию. Для того, чтобы исследоватьпричины этого перехода мы провели серию МД симуляций.80Рисунок 2.17. МД модель дисульфид-связанного димера RRM2 на основе структуры 1WF0,полученной в для раствора.
Дисульфидная связь C244-C244 отмечена золотым.Во-первых, мы построили несколько моделей дисульфид-связанных димеров RRM2 спомощью координат 1WF0 и, отдельно, рентгеновских координат 3D2W. Процедурапостроения этих моделей в силовом поле Amber ff14SB подробно описана в разделе 2.2.Материалы и методы. Первоначально два RRM2 домена располагаются полу-случайнымобразом. Затем применяется мягкий стягивающий потенциал, чтобы сблизить соответствующиетиольные группы C244, с использованием метода Марти-Ренома и Карплюса [92]. Вкратце,накладывается гармоническое ограничение на расстояние между двумя соответствующимиатомами серы в соответствии с начальным расстоянием между атомами; каждые 10 пстраектории МД ограничения обновляются, чтобы запомнить самое короткое расстояние от серыдо серы, которое достигается в течение этого интервала МД.
После того, как два атома серыдостигают расстояния меньше 2,5 Å друг от друга, образуется дисульфидный мостик, т.е.постепенно вводится набор ограничений соответствующий силовому полю для дисульфиднойсвязи [93]. Во время этой процедуры внутренняя структура доменов сохраняется с помощьюсинтетических ограничений расстояний между атомами. И, наконец, все вспомогательныеудерживающие ограничения удаляются и получается bona fide модель структуры дисульфидсвязанного димера RRM2, см.
Рисунок 2.17. Десять из этих моделей были выбраны с цельюобеспечения наилучшей выборки из фазового пространства (относительное положение иориентация доменов в димере). Эти модели были использованы в качестве стартовыхкоординат для записи десяти независимых траекторий длиной 1 мкс для дисульфид-связанныхдимеров. Кроме того, мы записали две 1 мкс траектории для контрольного мономерного RRM2.Изначально мы ожидали, что образование межмолекулярного дисульфидного мостикадолжно привести к ухудшению внутренней структуры домена. Действительно, интерфейсдомен-домен, сформированный вокруг дисульфидной связи (Рисунок 2.17) не являетсяестественным интерфейсом, то есть он не был оптимизирован в эволюционном смысле (в81отличие от нативных димеров).
Очевидно, что парные контакты аминокислотных остатков наэтой границе не оптимальны. В этих условиях взаимодействия на интерфейсе димера, наиболеевероятно, имеют дестабилизирующий эффект на отдельные домены RRM2 в димере. Подобныеаргументы были высказаны, чтобы объяснить дестабилизирующее воздействие клеточногокраудинга на структуру белка [128]. Чтобы проверить эту гипотезу, мы обратились к даннымМД.Мы использовали два параметра, чтобы характеризовать структурную стабильностьдоменов в МД: (i) Сα RMSD по отношению к исходным координатам и (ii) факторы защиты отобмена с растворителем для амидных протонов.
Последние были рассчитаны в зависимости отлокальной плотности упаковки и водородного связывания, используя протокол Best иVendruscolo [94]. Обе метрики не дали никаких доказательств того, что структура RRM2 какимлибо образом дестабилизирована за счет образования дисульфид-связанного димера, см.Рисунок 2.18. Ни одна из 10 траекторий димеров не показала каких-либо признаковструктурных изменений, за исключением незначительных возмущений, которые такженаблюдается в контрольных траекториях мономерного RRM2 (т.е. 1,5 Å RMSD для атомов Сαвторичной структуры).Рисунок 2.18.
Структурная стабильность доменов RRM2 в моделировании MD: глобулярныймономерный RRM2 (зеленые кривые) в сравнении с парой доменов RRM2, связанных черездисульфидную связь C244-C244 (красный и синий кривые). На панелях (A, B) показаны82данные, основанные на наборе координат 1WF0; на панелях (C, D) - данные, основанные нанаборе координат 3D2W. Данные включают (i) Cα RMSD относительно исходных координатPDB, рассчитанных по набору атомов, первоначально классифицированных как вторичнаяструктура, и (ii) коэффициенты защиты от обмена с растворителем для амидных протонов,рассчитанные согласно процедуре из [94]. Значения RMSD, превышающие 1,5 Å, в основномобусловлены флуктуациями шпильки β4β5. В случае мономера, петля в верхней части шпилькиотходит; в случае димеров β5 частично отделяется от β4 в течение ограниченного периодавремени. Несколько более высокие коэффициенты защиты по сравнению с мономеромнаблюдаются в димерах в окрестности остатка C244 из-за взаимного экранирования двухдоменов внутри димера.Наша неспособность наблюдать разворачивание RRM2 в МД симуляциях дисульфидсвязанных димеров – отрицательный результат.
Ясно, что этот результат также статистическиограничен: суммарная длина траекторий в этой работе составляет 10 мкс, в то время какхарактерное время разворачивания белка, как правило, существенно больше. Тем не менее, этототрицательный результат важен в контексте нашего исследования: он предполагает, чтоформирование случайного дисульфидного мостика между двумя доменами RRM2 вряд ли самопо себе вызывает разрушение доменных структур.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
