Диссертация (1150552), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Таким образом, приблизительная аддитивность их вкладов в наблюдаемую среднююскорость релаксации была доказана, и на этой основе была предложена модель гидратногоокружения молекул исследуемых ω-аминокислот. В предположении, что координационноечисло группы СН2, равно 7, что было предсказано квантово-химическими расчетами иподтверждено в эксперименте, было установлено, что времена корреляции вращательногодвижения молекул воды вблизи метиленовой группы в 1,5 ÷ 2 раза больше, чем времена длячистой воды. Средняя вращательная подвижность молекул воды в гидратных оболочкахгидрофильных групп ω-аминокислот немного медленнее, чем в чистом растворителе притемпературах выше 60°C , но при более низких температурах она составляет 0,8 ÷ 1,0 отзначений для времени корреляции в объемной воде. Несмотря на замедление обменааммонийных дейтронов в растворах глицина, формализм быстрого в шкале времени ЯМРобмена между всеми подструктурами может быть применен для описания релаксациидейтронов, так как этот процесс обмена существенно не влияет на наблюдаемую скоростьрелаксации.Представленный в данной работе подход, заключающийся в сочетании метода ЯМРрелаксации с квантово-химическими расчетами, позволил количественно охарактеризоватьдинамику сольватной воды в гидратных оболочках молекулярных групп.
Основное вниманиебыло уделено группе СН2. Предложенная методика обеспечивает основу для характеризацииразличных гидрофобных и гидрофильных частей молекул в удобных терминах временкорреляции вращательного движения ближайших молекул воды. Подход может быть примененк растворам других органических соединений (например, растворов с короткоцепочечныхповерхностно-активных веществ и ионных жидкостей) для количественного описаниягидратных оболочек в отдельных фрагментах молекул, а также может оказаться полезным дляанализа водно-белковых взаимодействий.35Глава 2. Разупорядочивание и агрегация белков при окислительновосстановительных процессах по данным ЯМР и других вспомогательныхбиофизических методовПоведение второго РНК-распознающего мотива RRM2 нейропатологического белкаTDP-43 под воздействием окислительного стресса, смоделированного в лабораторныхусловиях, является сложной для изучения системой и ставит перед автором диссертациибольшую задачу.
Для решения этой задачи мы предлагаем специально адаптированный вариантЯМР эксперимента 1H,15N HSQC для наблюдения H/D обмена, а также используем другиеметоды: ЯМР релаксация и диффузометрия, динамическое рассеяние света, контролируемыйпротеолиз,гель-электрофорез,сайт-направленныймутагенезимикросекундноеМД-моделирование. В окислительных условиях RRM2 образует дисульфид-связанные димеры,которые разворачиваются, а затем собираются в агрегатные частицы (AЧ). Эти частицы сильноразупорядочены, неоднородны и восприимчивы к протеолизу; некоторые из них противостоятобработке дитиотреитолом.
Они могут захватывать/высвобождать мономерный RRM2 черезреакции обмена тиол-дисульфид. Используя комбинацию динамического рассеяния света иданных диффузии ЯМР, была аппроксимирована функция распределения АЧ по размерам.Причиной наблюдаемой агрегации является уменьшенная способность дисульфид-связанныхдимеров RRM2 к рефолдингу и повышенная склонность к мисфолдингу, что делает ихуязвимымидлябольшихтепловыхвозмущенийструктуры.Возникающаяизэкспериментальных данных картина дает детальное представление о том, как окислительныйстресс может способствовать нейродегенеративным заболеваниям: с разворачиванием белка,его агрегацией и последующим протеолитическим расщеплением, как различными стадиямипроцесса.2.1.
Состояние проблемы разупорядочивания и агрегации белков приокислительно-восстановительных процессахСистема редокс сигнализации и регулирования в клетке обширна и сложна [17]. Однимиз важных элементов этой системы является антиоксидантная защита. Действительно,общеизвестно, что окислительный стресс может отрицательно влиять на липиды, белки и ДНК,что требует нескольких способов защиты. В случае белков типичными симптомамиокислительного повреждения являются потеря функции, дестабилизация и усиленныйпротеолиз [18, 19].
В общем случае, очевидно, что неизбирательные окислительные36модификации имеют тенденцию нарушать целостность и активность белка. Однако на данныймомент было выполнено относительно мало работ по детальной структурной характеризацииокислительно поврежденных белков.Основными мишенями окислительной модификации в белках являются тиольныегруппы цистеина, которые образуют дисульфидные связи.
Зачастую этот процесс становитсякритически важным в контексте болезни. Например, межмолекулярные дисульфидные мостикибыли непосредственно вовлечены в превращение нормальной клеточной формы прионногобелка PrP в инфекционную форму [20]. В то же время дисульфид-связанные димеры белка tauпоказываютприон-подобныеОкислительныйстрессхарактеристики,приводиткиндуцирующиеобразованиюtau-патологиюдисульфид-связанных[21].агрегатовсупероксиддисмутазы SOD1, которые связаны с боковым амиотрофическим склерозом [22, 23].Тот же механизм применим для телец включений, образованных нейропатологическим белкомTDP-43, которые также связаны с боковым амиотрофическим склерозом, а также лобновисочной дегенерацией [24].
По всей видимости, такие дисульфид-связанные белковыеотложения образуются, когда клетка приближается к смерти, а редокс-гомеостаз сильнонарушен. Тем не менее, они явно остаются ключевым элементом нейродегенерации ипотенциальной терапевтической мишенью [25].В этом исследовании мы фокусируемся на втором РНК-распознающем мотиве (RRM2)белка TDP-43. Этот домен содержит два цистеина: C198 и C244.
Cohen и др. показали, что этицистеины участвуют в образовании дисульфид-связанных агрегатов полноразмерного TDP-43[24]. Кроме того, эти цистеины являются достаточным условием для формирования такихагрегатов (агрегаты наблюдались в клетках, которые сверхэкспрессировали конструкцию TDP43, в которой отсутствовали другие ключевые цистеины). Кроме того, RRM2 является сайтомпротеолитического расщепления, приводящего к образованию определенных С-концевыхфрагментов [75-77]. Эти фрагменты, по-видимому, играют важную роль в патогенезепротеинопатий TDP-43 [78-80]. Мы предполагаем, что протеолитическое расщепление в доменеRRM2 тесно связано с его склонностью к образованию дисульфид-связанных агрегатов.В данной работе мы попытались охарактеризовать поведение домена RRM2 поддействием окислительного стресса. С этой целью мы использовали специально адаптированнуюверсию экспериментов по H/D обмену, эксперименты по15N ЯМР-релаксации и измерениюдиффузии с помощью градиента магнитного поля, измерения ДРС в сочетании с HSQCспектрами ЯМР, контролируемый протеолиз, сайт-направленный мутагенез и моделированиеМД.
Получившаяся картина схематически проиллюстрирована на Рисунок 2.1. При воздействии37окислительной среды RRM2 образует дисульфид-связанные димеры (db-RRM2). Эти димерысклонны к самоассоциации и объединению в агрегатные частицы (АЧ), то есть растворимыевключения умеренного размера, состоящие из частично сшитых неупорядоченных пептидныхцепей. Неудивительно, что эти частицы оказываются уязвимыми для протеолитическогорасщепления.
При восстановлении дитиотреитолом большая часть белка возвращается вмономерное состояние. Однако значительная его часть остается в агрегированном состоянии –небольших АЧ, которые больше не зависят от дисульфидных связей [81].Рисунок 2.1. Схематическое представление поведения RRM2 TDP-43 во время окислительновосстановительного цикла. Свободные боковые цепи цистеинов (экспонированный врастворитель C244 и скрытый внутрь структуры C198) обозначены красными палочками;дисульфидные связи показаны в виде желтых полосок. Зеленые точки на С-конценеупорядоченного белка соответствуют терминальному остатку N265, который экспонирован врастворитель и остается высокоподвижным.Особый интерес представляет механизм перехода от дисульфид-связанных димеров кАЧ.
Наши результаты показывают, что (i) образование АЧ не зависит от присутствиядисульфидно-связанной сети, напротив достаточно иметь лишь две белковые единицы,связанные одной дисульфидной связью, и (ii) критической стадией в образовании АЧ являетсяокислительная димеризация RRM2. Основываясь на экспериментальных данных, а также нарезультатах МД-моделирования, мы предлагаем простой механизм формирования агрегатныхчастиц. Пример RRM2 показывает то, как небольшой глобулярный домен, подвергшийсяокислительному стрессу, может стать точкой инициации для образования белковых телец.382.2. Материалы и методыЭкспрессия и очистка RRM2Векторы pET-15 для RRM2 (дикий тип, мутанты C198S и C244S) кодирующие остатки191-265 человеческого TDP-43 были приобретены у GenScript.
Белки, дополнительносодержащие N-концевой метионин, были экспрессированы в клетках Rosetta DE3 (Novagen) сиспользованием минимальной среды М9 (при необходимости с добавлениемхлорида аммония и15N-меченого13C-меченой глюкозы); экспрессия индуцировалась по достижении OD600значения 0,8. После 16 часов инкубации при 37°С, клетки собирали, ресуспендировали встандартном буфере для лизиса (содержащего 10 мМ β-меркаптоэтанола) и затемгомогенизировалив криомельнице SPEX SamplePrep 6870 с последующей обработкойультразвуком на льду (3 раза по 30 с). Образцы были очищены с помощью ионообменной игель-фильтрационной хроматографии (колонки GE HiTrap Q HP и GE Sephacryl S-200 HR). Дляразличных экспериментальных измерений мы использовали образцы, содержащие 1 мМ RRM2,20 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl при рН 6,7, температура 25°C (стандартные условияобразца), если не указано иное.ДСН-ПААГСвежеприготовленный белковый материал выдерживали в течение нескольких дней вфосфатном буфере с 25 мМ дитиотреитола (DTT).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
