Диссертация (1150126), страница 12

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 12)

Для оценки жизнеспособности клетки использовали два ДНК-связывающихкрасителя: YO-PRO-1 и пропидий иодид (PI). Измерения проводили с помощьюметода проточной цитометрии. Концентрации соединений 5k,p,u,22b,c,d,i,l,n,oварьировались в диапазоне от 10-5 до 2×10-4 M.Для адекватного описания и количественной оценки апоптотического илинекротического потенциала тестируемых соединений, с одной стороны, и общегоцитотоксического потенциала, с другой стороны, сравнивали апоптозно-некрознуюразницу (AND), т.е. разницу между площадью под кривой зависимости апоптоза отконцентрации вещества и аналогичной величиной для некроза.

Полученныезначения AND для соединений 5k,p,u,22b,c,d,i,l,n,o представлены в таблице 11 ипроиллюстрированы диаграммой на рисунке 10. Из этих данных видно, что в рядупротестированных соединений налицо существенное различие не только вспособности вызывать гибель клеток, но и в механизмах, по которым онареализуется с превалированием либо апоптоза, либо некроза. Для дигидроазета 22bполучено максимальное значение AND, что свидетельствует о его отчетливовыраженном апоптоз-стимулирующем действии (рисунок 11). Для соединений8822n,o,l получены несколько меньшие значения этой величины за счет болеевысокого некротического потенциала при таком же уровне цитотоксичности, что иу соединения 22b.

Еще более низкие значения AND продемонстрировалидигидроазеты 22c,d и 5k, что обусловлено их повышенным некротическимпотенциалом и пониженной цитотоксичностью. Соединение 22i имеет не тольконизкое значение AND, но и низкую цитотоксичность в целом, в то время какдигидроазеты5p,uпродемонстрировалиотрицательноезначениеапоптоз-некрозной разницы из-за преимущественно некрозного пути гибели клеток приумеренном уровне цитотоксичности.Таблица 11. Значения апоптоз-некрозной разницы (AND) для дигидроазетов5k,p,u,22b,c,d,i,l,n,o на клеточной линии THP-1СоединениеANDСоединениеAND7.7 ± 1.58.3 ± 2.4-28.5 ± 22.7 ± 0.9-15.1 ± 0.913.0 ± 2.119.9 ± 116.1 ± 2.39.5 ± 0.513.5 ± 2.689Рисунок 10.

Диаграмма изменений апоптоз-некрозной разницы (AND) в рядудигидроазетов 5k,p,u,22b,c,d,i,l,n,o, показанная на клеточной линии THP-1Таким образом, из протестированных веществ наиболее перспективнымсоединением как базовой структуры для дальнейших поисков противоопухолевыхпрепаратов с высокой апоптоз-стимулирующей актвностью явялется триметил4-фенил-2,3-дигидроазет-2,2,3-трикарбоксилат 22b.90Рисунок 11. Концентрационная зависимость (моль/л) стимуляции апоптоза и некроза в ряду дигидроазетов 5k,p,u,22b,c,d,i,l,n,o, показанная на клеточной линии THP-1.914. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬТемпературу плавления веществ определяли на приборе SMP30, приведенынеисправленные значения. ИК спектры снимали на приборе SPECORD M80 (врастворе хлороформа).

Спектры ЯМР записывали на приборах Bruker DPX-300(рабочие частоты 300 (1Н), 75 (13С) МГц) или Bruker DPX-400 (рабочие частоты 400(1Н), 100 (13С) МГц). Масс-спектры получали на масс-спектрометре BrukermicrOTOF или MaXis. Элементный анализ выполняли на CHN-анализатореEuroЕА3000. Данные рентгеноструктурного анализа получали на дифрактометрахBruker SMART-6000, Agilent Gemini S-Ultra, Agilent Technologies Xcalibur иSupernova. Контроль за ходом реакции осуществляли методом ТСХ на пластинахALUGRAM SIL G/UV254. Для разделения реакционных смесей использовалисиликагель Merck 60.

Толуол был перегнан над натрием, 1,2-дихлорэтан (DCE)промывали концентрированной H2SO4, затем водой, перегоняли над P2O5 и хранилинад прокаленным K2CO3.Квантово-химические расчеты были выполнены c использованием пакетапрограмм Gaussian 09 Rev. C.01. Оптимизацию геометрии реагентов, продуктов,интермедиатов и переходных состояний проводили методом DFT mPWB1K/631+G(d,p) или B3LYP/6-31+G(d,p).

Нахождение переходных состояний на одномэнергетическом профиле с реагентами и продуктами прослеживалось внутреннейкоординатой реакции (IRC).Работа выполнена с использованием оборудования ресурсных центров СПбГУ«Магнитно-резонансные методы исследования», «Методы анализа состававещества», «Вычислительный центр СПбГУ», «Рентгенодифракционные методыисследования» и «Образовательному ресурсному центру института Химии».Автор выражает благодарность сотрудникам РЦ за помощь при выполненииработы.924.1.

Синтез исходных соединений4.1.1. Синтез метил-2-галоген-2Н-азирин-2-карбоксилатов 1аjСинтез (2-метокси-2-оксоэтил)трифенилфосфоний хлорида [84]К раствору трифенилфосфина (26.2 г, 0.1 моль) в безводном этилацетате (200мл) прибавили метил-2-хлорацетат (11.5 г, 0.106 моль). Смесь кипятили с обратнымхолодильником при перемешивании 30 ч.

Выпавший осадок отфильтровали,промыли этилацетатом и растворили в минимальном количестве CH2Cl2. Кполученному раствору по каплям добавили безводный этилацетат до полноговыпадения соли фосфония, который отфильтровали и высушили в вакууме прикомнатной температуре.

Выход (2-метокси-2-оксоэтил)трифенилфосфоний хлоридасоставил 27 г (73%). Бесцветное кристаллическое вещество, т. пл. 150153 С (лит.т. пл. 152153 С [84]). Спектр ЯМР 1Н (300 МГц, CDСl3), , м.д.: 3.60 с (3Н, СН3),5.83 д (2Н, СН2, J 3.4 Гц), 7.677.81 м (10Н, Наром), 7.897.96 м (5Н, Наром).Синтез метил-2-(трифенилфосфоранилиден)ацетата [64].К раствору (2-метокси-2-оксоэтил)трифенилфосфоний хлорида (19.3 г 26ммоль) в воде (100 мл), охлажденному до 0 С, при интенсивном перемешиваниибыстро прилили (20 мл) охлажденного 50%-ного водного раствора NaOH.Выпавший осадок быстро отфильтровали, промыли водой до нейтральной реакцииивысушиливвакууме.Выход метил-2-(трифенилфосфоранилиден)ацетатасоставил 15.2 г (88%). Бесцветное кристаллическое вещество, т.

пл. 158160 С(лит., т. пл. 162163 С [64]). Спектр ЯМР 1Н (300 МГц, CDСl3), , м.д.: 2.91 с (1Н,СН), 3.53 с (3Н, СН3), 7.467.72 м (15 Н, Наром).Общая методика синтеза метил-3-оксо-2-(трифенилфосфоранилиден)пропионатов 6a−g [65].К раствору метил-2-(трифенилфосфоранилиден)ацетата (10 г, 30 ммоль) вбезводном бензоле (250 мл) добавили соответствующий ацилхлорид (15 ммоль).Смесь кипятили с обратным холодильником при перемешивании в течение 4 ч.Выпавшийосадок(2-метокси-2-оксоэтил)трифенилфосфонийхлорида93отфильтровали, а фильтрат сконцентрировали в вакууме. Полученный остатокочищали с помощью флэш-хроматографии на силикагеле с использованием смесиэтилацетатгексан (1:1) в качестве элюента.Метил-3-оксо-2-(трифенилфосфоранилиден)-3-фенилпропионат (6a)Соединение 6a (5.76 г, 88%) было получено из бензоилхлорида (2.11 г, 15ммоль) по общей методике в виде бесцветного кристаллического вещества. Т. пл.132134 С (лит.

т. пл. 136137 С [85]). Спектр ЯМР 1Н (300 МГц, CDСl3), , м.д.:3.16 с (3Н, СН3), 7.327.41 м (3Н, Наром), 7.447.62 м (9Н, Наром), 7.667.84 м (8Н,Наром).Метил-3-(4-метоксифенил)-3-оксо-2-(трифенилфосфоранилиден)пропионат(6b)Соединение 6b (6.68 г, 95%) было получено из 4-метоксибензоилхлорида (2.56г, 15 ммоль) по общей методике в виде бесцветного кристаллического вещества. Т.пл. 175177 С. Спектр ЯМР 1Н (400 МГц, CDСl3), , м.д.: 3.20 с (3Н, СН3), 3.85 с(3H, CH3), 6.896.91 д (2Н, Наром, J 8.8 Гц), 7.477.58 м (9 Н, Наром), 7.767.83 м (8Н,Наром).

Спектр ЯМР 13С (100 МГц, CDСl3) , м.д.: 49.6, 55.2, 68.3 д (J 112 Гц), 112.4,126.3 д (J 93 Гц), 128.5 д (J 12.5 Гц), 130.6, 131.7 д (J 3 Гц), 133.3 д (J 10 Гц), 135.2 д(J 9 Гц), 161.0, 168.0 д (J 14.5 Гц), 192.2 д (J 5 Гц). HRMS (ESI-TOF): вычисленодля С29Н26O4P+ [M+Н]+: 469.1563; найдено: 469.1576.Метил 3-(2-нафтил)-3-оксо-2-(трифенилфосфоранилиден)пропионат (6с)Соединение6с(5.86г,80%)былополученоввидебесцветногокристаллического вещества по общей методике из 2-нафтоилхлорида (2.86 г, 15ммоль). Т. пл. 162163 С. Спектр ЯМР 1Н (400 МГц, CDСl3), , м.д.: 3.17 с (3Н,СН3), 7.437.63 м (11Н, Наром), 7.787.96 м (10Н, Наром), 8.23 уш.с (1Н, Наром).Спектр ЯМР 13С (100 МГц, CDСl3), , м.д.: 49.8, 69.3 д (J 112 Гц), 125.6, 126.1 д (J94 Гц), 126.29, 126.3, 126.4, 127.5, 127.9, 128.6 д (J 12 Гц), 128.9, 131.85 д (J 3 Гц),132.8, 133.4 д (J 10 Гц), 134.1, 140.4 д (J 9 Гц), 168.0 д (J 15 Гц), 193.0 д (J 6 Гц).HRMS (ESI-TOF): вычислено для С32Н26O3P+ [M+H]+: 489.1614; найдено: 489.1621.94Метил-3-оксо-2-(трифенилфосфоранилиден)-3-(фуран-2-ил)пропионат (6d)Соединение 6d (5.34 г, 83%) было получено из фуран-2-карбонилхлорида (1.96г, 15 ммоль) по общей методике в виде бесцветного кристаллического вещества.

Характеристики

Список файлов диссертации