Диссертация (1145983), страница 25
Текст из файла (страница 25)
У всех пациентокбыла зарегистрирована гипертоническая болезнь. В группе сравнения у одной женщины былдиагностирован хронический пиелонефрит.3.2.2 Анализ данных секвенированияВрезультатесеквенированиябылополучено3744045чтений(нуклеотидныхпоследовательностей отсеквенированных фрагментов ДНК), из них 1502484 чтений для 5образцов пациенток с гестозом и 2241561 чтений для 6 образцов женщин группы сравнения.Средняя длина чтений варьировала от 19 до 24 нуклеотидов.
Чтения, прошедшие фильтрациюпо длине и качеству, составили 1502484 для группы с гестозом и 2241561 - для группысравнения, соответственно. Среди них на последовательности генов микроРНК быликартированы 606821 и 805102 чтений для группы больных и выборки женщин без осложненийбеременности. Число картированных чтений было более 5 для 466 и 522 выявленных микроРНКв образцах плаценты от женщин с гестозом и женщин без осложнений беременности (таблица40).Таблица 40 - Результаты секвенирования[из статьи Vashukova et al., 2016]ПараметрОбщее количество чтений, nЧтения низкого качества, nЧтения длиной менее 17 нуклеотидов, nЧтения после фильтрации, nЧтения, картированные на референсный геном человекаhg19 и базу известных микроРНК mirBase, nЧтения, картированные на последовательности геновмикроРНК, nМикроРНК, для которых число картированных чтенийболее 5Группа пациенток сгестозом (n=5)150248458019 (3,9%)236655 (15,8%)1207080Группа сравнения (n=6)2241561100821 (4,5%)296599 (13,2%)1844141827455 (68,6 %)1184799 (64,2%)606821805102466522При сравнительном анализе распределения общего числа чтений, числа чтений послефильтрации, картирования на референсный геном и на последовательности генов микроРНКмежду группами с гестозом и без осложнений беременности не было выявлено статистическизначимых отличий (p>0,05).На рисунке 16 представлено распределение типов РНК, на последовательности геновкоторых были картированы отфильтрованные чтения.100интронныеРНК; 0,1мяРНК; 0,7рРНК; 0,1антисмысловыемежгенныеРНК; 0,2некодирующиепре-мРНК; 3,3 РНК; 12,2мякРНК; 5,2МТ тРНК; 1,5МТ рРНК; 0,2другие РНК; 0,7мРНК; 1,5РНК псевдогенов;0,4Группапациенток сгестозоммикроРНК; 73,9мякРНК; 7,4интронныеРНК; 0,1МТ тРНК; 1,7мяРНК; рРНК; 0,10,9антисмысловыеРНК; 0,3межгенныенекодирующиеРНК; 12,2пре-мРНК; 3,3МТ рРНК; 0,2другие РНК; 0,8мРНК; 1,6РНК псевдогенов;0,4ГруппасравнениямикроРНК; 71,0Рисунок 16 - Распределение различных типов РНК в образцах плаценты от женщин с гестозом иженщин без осложнений беременности [из статьи Vashukova et al., 2016]Примечание - Для каждого типа РНК указана доля (в %) от всех выявленных РНК.Исследуемые группы были сопоставимы по содержанию разных типов РНК (p>0,05).Для образцов обеих групп наибольшее число чтений было картировано в областях генома,соответствующихгенаммикроРНК.ДолямикроРНКсредивсехсеквенированныхпоследовательностей для группы больных с гестозом составила 73,9%, для группы сравнения 71,0%.Подсчет чтений, картировавшихся на гены микроРНК, позволил сравнить образцыплацент при гестозе и в норме по содержанию микроРНК.3.2.3 МикроРНК, содержание которых изменено в образцах плаценты пригестозе по сравнению с нормойВ результате сравнительного анализа нами были выявлены 22 микроРНК, содержаниекоторых статистически значимо различалось с учетом поправки Бенжамини-Хохберга[Benjamini and Hochberg, 1995] (pcor<0,05) в образцах плаценты от женщин с гестозом и без101осложнений беременности.
Было увеличено содержание 15-и микроРНК (miR-515-3p, miR-31,miR-210, miR-518a, miR-524, miR-518c, miR-520a, miR-515-5p, miR-516a-5p, miR-519e*, miR193b, miR-4532, miR-518f, miR-527 и miR-518e) и снижено содержание 7-и микроРНК (miR135b, miR-195, miR-let-7f, miR-34c, miR-1, miR-98, miR-223) (рисунок 17).3miR-223miR-98miR-1miR-34clet-7fmiR-195miR-135bmiR-518emiR-527miR-518fmiR-4532miR-193bmiR-519e*miR-516a-5pmiR-515-5pmiR-520amiR-518cmiR-524miR-518a-1miR-310miR-210-3p1miR-515-3pLog 2 FC2-2-3Рисунок 17 - Значения кратности изменения уровней 22 микроРНК в образцах плаценты пригестозе относительно нормы (pcor <0,05) [из статьи Vashukova et al., 2016]Примечание - Log2FC (FC - fold change) отражает кратность изменения содержания РНК в плацентахпациенток с гестозом по сравнению с нормой.В таблице 10 приложения Б приведены значения pcor, FC и log2FC для этих микроРНК.102ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕИзучение молекулярно-генетических основ развития гестоза является одной изактуальных задач современной молекулярной биологии и медицины.
В настоящей работе былапредпринята попытка оценить роль вариаций в нуклеотидной последовательности 20 генов,относящихся к различным функциональным и метаболическим системам, в развитии гестоза.Были обследованы 256 женщин, проживающих в Санкт-Петербурге и Ленинградскойобласти, в том числе 157 пациенток с гестозом и 99 женщин с беременностью без осложнений.Анализ историй родов и новорожденных показал, что к факторам риска гестозаотносятся возраст (p=0,0002) и различные соматические патологии (р<0,0001, ОШ=17,86):гипертоническая (p<0,0001) и варикозная болезни (p=0,0326, ОШ=2,36), заболевания почек(p=0,0003, ОШ=2,90), патологии щитовидной железы (p<0,0001, ОШ=9,54), сахарный диабет(p<0,0001) и ожирение (p<0,0001, ОШ=3,59).
При этом гестоз характеризуется повышеннойчастотой угрозы прерывания (p=0,0002, ОШ=2,76), многоводия (p<0,0001, ОШ=7,32) и развитиягестационного диабета (p<0,0001). Он связан с необходимостью досрочного родоразрешения(p<0,0001), рождением детей с более низкими весо-ростовыми показателями (р<0,001 - для веса,р<0,001 - роста и p<0,0001 - для ИМТ), баллами по шкале Апгар (p<0,0001) и худшимипоказателями здоровья новорожденных при выписке (p<0,0001, ОШ=35,59). Полученныерезультаты согласуются с данными других авторов [Мозговая, 2003; Спиридонова и др., 2006;Павлова и др., 2010; Киселевич и др., 2011; Халфорд-Князева и др., 2013; Häkli et al., 2003; Ayazet al., 2009].При изучении результатов клинико-лабораторных исследований установлено, что длягестоза характерны изменения, свидетельствующие о гиперкоагуляционном потенциале крови,дисфункции эндотелия, изменениях метаболизма липидов с преобладанием атерогенногохолестерина и нарушениях функционирования печени.
Эти результаты подтверждают данныелитературы [Репина, 2005; Сидорова, 2007; Айламазян и Мозговая, 2008; Баранова иБольшакова, 2008] и соответствуют гипотезе о возможной роли выбранных генетическихвариаций в патогенезе гестоза. В настоящее исследование были включены гены, изменения внуклеотидной последовательности которых ассоциированны с повышенной свертываемостьюкрови, эндотелиальной дисфункцией и нарушениями метаболизма липидов. Также принимая вовнимание значение АГ как основного диагностического симптома гестоза, были выбраныполиморфные участки генов, белковые продукты которых участвуют в регуляции АД. Вчастности, нами была изучена связь с развитием гестоза вариантов полиморфных сайтов геновсистемы свертывания крови (F7 rs6046, F5 rs6025, F2 rs1799963, FGB rs1800790, ITGB3 rs5918,ITGA2 rs1126643 и PAI1 rs1799768), генов регуляции АД (REN rs2368564, AGT rs699, AGTR1103rs5186, AGTR2 rs11091046, BKR2 rs1799722, ADRB2 rs1042713 и rs1042714), генов дисфункцииэндотелия (NOS3 rs1800779 и MTHFR rs1801133) и генов метаболизма липидов (LPL rs328,APOA1 rs4938303, SCARB1 rs5888, NR1H2 rs2695121 и CETP rs3764261).Существует несколько стратегий изучения связи генетических факторов с развитиемгестоза.
Наиболее распространенным является подход, основанный на исследованииассоциаций генетических вариантов с риском гестоза. Именно в таких работах полученыпрактически все данные о генетической основе гестоза, имеющиеся в настоящее время. Помимоидентификациидостаточнобольшогочислагенов-кандидатов,этиисследованияпродемонстрировали необходимость проведения исследований, направленных на поискассоциаций генетических факторов как с гестозом в целом, так и с конкретными клиническимиформами патологии.В акушерской практике используется разделение гестоза по степени тяжести.
Однакопри оценке тяжести гестоза существуют разногласия относительно того, какой уровень АД ипротеинурии считать повышенным. В большинстве иностранных публикаций, посвященныхгенетике гестоза, используются классификации, в которых критерием АГ является повышениеСАД≥140 мм.рт.ст. и/или ДАД≥90 мм.рт.ст. Тяжелые формы патологии определяются прицифрах САД≥160 мм.рт.ст. и/или ДАД≥110 мм.рт.ст. Индикатором гестоза являетсяпротеинурия более 0,3 г/л в сутки [Lowe et al., 2009; Staines-Urias et al., 2012].
В Российскойклассификации критерии постановки диагноза менее строгие, что с одной стороны позволяетсвоевременно начать лечение, предупредить переход патологии в более тяжелую форму иснизить частоту неблагоприятных исходов [Мозговая и Зайнулина, 2008]. С другой стороныотсутствие единой классификации создает сложности при сравнении результатов исследованийразных авторов. Считается, что одной из причин противоречивости данных об участиигенетических факторов риска в развитии гестоза может быть использование разных критериевпри формировании групп больных [Chappell and Morgan, 2006], поэтому при проведенииассоциативных исследований важно учитывать особенности классификаций гестоза.В литературе встречается разделение на гестоз с ранним началом - до 34 недель и гестозс поздним началом - после 34 недель [Oudejans et al., 2007].
Существует гипотеза, что гестоз сранним началом возникает вследствие нарушений процессов плацентации. Развитие патологиипосле 34 недель в первую очередь обусловлено наличием неблагоприятных факторов у самойбеременной [Oudejans et al., 2007]. Вполне вероятно, что развитие этих двух форм гестозаможет быть связано с разными генетическими факторами.В работах отечественных авторов показано, что гестоз клинически различается уженщин с различными фоновыми заболеваниями [Макаров и др., 2010], и степень ассоциациигенетических факторов с этим осложнением беременности может варьировать в зависимости от104сопутствующихзаболеваний[Мозговая, 2003;Павлова, 2011]. Поэтому интереснымпредставляется изучение роли генетических факторов в развитии гестоза у женщин с разнымифоновыми заболеваниями.В связи с вышеизложенным нами был проведен анализ ассоциации вариантоввыбранных полиморфных сайтов генов-кандидатов с риском развития гестоза в целом и егоотдельных клинических форм в зависимости от тяжести, уровня АД (≥140/90, 140/90-160/110 и≥160/110 мм.рт.ст.) и протеинурии (<0,3 и ≥0,3 г/л в сутки), срока манифестации (до и после 34недели) и наличия сопутствующих заболеваний.Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов-кандидатов у пациенток сгестозом и беременных без осложнений выявил ассоциацию с гестозом (или его формами) 10-ииз 21-ой исследованных генетических вариаций.Так, впервые, обнаружена ассоциация с гестозом замены 10976G>A (rs6046) в генекоагуляционного фактора VII F7.
В двух более ранних работах, выполненных на чилийской ифинской популяциях, ассоциации вариантов этой замены с гестозом не было выявлено[Laasanen et al., 2002; Goddard et al., 2007]. Между тем, наши исследования показали, чтогенотип AA имеет протективный эффект (p=0,0275, ОШ=0,07). Можно предполагать, что такойфенотипическийэффектобусловленингибированиемкоагуляционногокаскадаи,следовательно, уменьшением тромботических осложнений и гестоза.Впервые, выявлена зависимость риска возникновения определенных клинических формгестоза от вариантов rs1126643 (807C>T) гена интегрина ITGA2. С одной стороны обнаруженаассоциация "неблагоприятного" генотипа TT с гестозом у больных с АД более 160/110 мм.рт.ст.(p=0,0075, pcor=0,0225; ОШ=3,06).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
