Диссертация (1145941), страница 17
Текст из файла (страница 17)
На основе нашихданных,экспрессияMedtr2g091125,Medtr2g437800,Medtr2g015445,Medtr4g087850 увеличиваются при клубенькообразовании (Рисунок 51).Рисунок 51 - Уровни экспрессии генов CLE на разных сроках развитияклубеньков (3-21 дни после инокуляции (dpi), NI-5d и NI-7d – контроли безинокуляции).Таким образом, кроме ранее идентифицированных генов CLE были найденыещёчетырегенаCLE,экспрессиякоторыхувеличиваетсяприклубенькообразовании, и которые могут быть вовлечены в AON, как и геныCLE12/13.118Изучение влияния нитрата на экспрессию CLE пептидовНедостаток азота в почве является необходимым условием для развитияклубеньков, тогда как высокие концентрации азота (в форме нитрата илиаммиака) подавляют образование клубеньков (Barbulova, et al., 2007, Carroll, et al.,1985, Rautenberg and Kuhn, 1864).
Было показано, что мутации в Har1, NTS1/Narkи SUNN проявляют устойчивый к действию нитрата фенотип (Barbulova, et al.,2007, Carroll, et al., 1985, Magori, et al., 2009, Oka‐Kira, et al., 2005, Wopereis, et al.,2000).У Lotus japonicus были найдены CLE-пептиды (CLE-RS2/3), экспрессиякоторых индуцируется нитратом (Nishida, et al., 2016, Okamoto, et al., 2009). Былопоказано, что сверхэкспрессии этих генов сильно подавляет образованиеклубеньков.
Кроме того, системное подавление образования клубеньков ненаблюдается у суперклубенькообразующего мутанта har1, это позволяетпредложить,чтоHar1функционируетпослеLjCLE-пептидов.Ранеесуществование активируемого нитратом CLE-пептида, вовлеченного в AON, былопоказано также для сои (Reid, et al., 2011), но у люцерны такой CLE-пептид небыл охарактеризован.Чтобы проверить, могут ли источники азота влиять на индукцию генов CLE уMedicago truncatula, мы обрабатывали растения 10 mM KNO3 в течение 24 часов.Затем оценивали экспрессию генов CLE в ответ на нитрат. Было обнаружено, чтоэкспрессия гена Medtr2g091125 сильно индуцируется в корнях в ответ на нитрат(Рисунок 52). Изменение экспрессии других генов CLE в ответ на нитрат необнаружено.
Таким образом, нами был найден нитрат-индуцируемый CLE-пептиду люцерны.119Рисунок 52 - Влияние нитрата на экспрессию генов CLE (*** соответствует Pvalue < 0.001).Гены Medtr2g091120 и Medtr2g091125, располагаются тандемно на хромосоме2. Ген Medtr2g091120 является близким ортологом NIC1 у сои, однако замена Cна T в позиции 148 этого гена приводит к образованию преждевременного стопкодона, и, следовательно, его продукт, вероятно, является нефункциональным(Hastwell, et al., 2017).
Эти данные согласуются с нашим наблюдением оботсутствии активации экспрессии этого гена при развитии клубеньков. Нафилогенетическом дереве Medtr2g091125 также группируется вместе с симбиозспецифичными CLE-пептидами сои, фасоли и лядвенца. Интересно, чтоMedtr2g091125 содержит консенсусную последовательность TLQAR, котораяхарактерна для CLE-пептидов, подавляющих клубенькообразования (Hastwell, etal., 2017).
Так как по нашим данным этот ген индуцируется нитратом, он можетбыть хорошим кандидатом как индуцируемого ризобиями, так и нитратиндуцируемого CLE-пептида подавляющего клубенькообразование, подобноCLE-RS2 и CLE-RS3 лядвенца (Nishida, et al., 2016, Okamoto, et al., 2009).1203.5.2.2. Изучение влияния подавления экспрессии гена MtKNOX3 наэкспрессию CLEНа следующем этапе мы проанализировали влияние подавления экспрессиигена MtKNOX3 (См. раздел 3.2) на экспрессию генов CLE, увеличение экспрессиикоторых мы показали при развитии клубеньков.
На основе наших данных,экспрессия Medtr2g437800, Medtr4g087850 показывает статистически значимоеуменьшение в трансгенных корнях с подавлением MtKNOX3 (MtKNOX3-RNAi) посравнению с контролем (Рисунок 53). Экспрессия других проанализированныхгенов не изменяется (CLE13, CLE12, Medtr2g091125 и Medtr2g015445).Рисунок 53 - Снижение уровней экспрессии генов Medtr2g437800, Medtr4g087850на фоне подавления экспрессии MtKNOX3 путём интерференции РНК (MtKNOX3RNAi) в клубеньках на трансгенных корнях (*, **, *** соответствует P value < 0.05,< 0.01 и < 0.001, соответственно).Анализ промоторных последовательностей этих генов не выявил наличиядвухмотивовTGAC,которыехарактерныдлясайтовсвязываниятранскрипционных факторов MtKNOX. На основе этого наблюдения и такжесогласно данным, полученных Mortier и соавторами, о том что CLE пептиды, вчастности CLE13, индуцируются цитокинином (Mortier, et al., 2010) и действуютпосле LOG1 (Mortier, et al., 2014), мы предполагаем, что CLE-пептиды неявляются прямыми мишенями транскрипционного фактора MtKNOX3, и121подавление их экспрессии в трансгенных корнях с РНК-интерференциейMtKNOX3 происходит за счёт изменения уровня цитокинина.Таким образом, ТФ MtKNOX3 в корнях и через его действие на продукциюцитокинина регулирует CLE пептиды и могут быть вовлечён в AON.122Глава 4.
ЗаключениеТранскрипционные факторы KNOX играют важную роль в развитии растений.Известно, что гены KNOX важны для поддержания клеток апикальной меристемыпобега в недифференцированном состоянии. Мишенями транскрипционныхфакторов (ТФ) KNOX (KNAT1, STM) в меристеме побега являются геныбиосинтеза цитокинина (IPT) (Jasinski, et al., 2005, Yanai, et al., 2005). В настоящейдиссертационной работе выдвинута гипотеза об участии ТФ KNOX в активациигенов биосинтеза цитокинина при развитии клубеньков.В нашей работе мы впервые показали участие транскрипционных факторовMtKNOX (MtKNOX3/5/9) в развитии клубеньков (Azarakhsh, et al., 2015).
Наосновании полученных данных мы предлагаем схему, объясняющую участие ТФMtKNOXвразвитииклубеньковиихместовавторегуляцииклубенькообоазования (Рисунок 54).Среди проанализированных генов MtKNOX (MtKNOX1-10) для болееподробного изучения нами был выбран ген MtKNOX3, поскольку его экспрессияпри клубенькообразовании повышается в значительно большей степени, чем удругих генов MtKNOX. Анализ активности промотора гена MtKNOX3 подтвердилналичие его экспрессии при формировании примордиев клубеньков, а также наболее поздних этапах развития клубеньков - в месте формирования будущихпроводящих тканей и меристемы клубенька. Полученные нами результаты поэкспрессии генов MtKNOX (Azarakhsh et al., 2015), позднее были подтверждены вработе другой исследовательской группы (Di Giacomo, et al., 2016).
Кроме того,была выявлена активация экспрессия ряда генов MtIPT и MtLOG в клубеньках вответ на инокуляцию (Azarakhsh, et al., 2015, Azarakhsh, et al., 2018). Данные поактивацииэкспрессииLOG1/2такжесогласуютсясисследованиемопубликованным Mortier и соавторами в 2014 г.
(Mortier, et al., 2014).Образование клубенькоподобных структур (спонтанных клубеньков) натрансгенных корнях со сверхэкспрессией MtKNOX3 и тот факт, что в этихструктурах наблюдается повышение экспрессии гена цитокининового ответа123(RR4) и также генов MtIPT3 и MtLOG2, наряду с данными об уменьшенииэкспрессии этих генов в корнях с подавлением экспрессии MtKNOX3 путёминтерференции РНК, указывает на то, что ТФ MtKNOX3 вовлечён в активациюбиосинтеза цитокинина (Azarakhsh et al., 2015). В дополнение к этому, намудалось показать непосредственное взаимодействие гомеодомена MtKNOX3 спредполагаемыми последовательностями-мишенями в промоторах или интронахгенов MtIPT (MtIPT3/5) и MtLOG (LOG1/2) с помощью двух методов, EMSA иSPR. Эти данные в совокупности указывают на то, что гены биосинтезацитокинина являются прямыми мишенями ТФ MtKNOX3 (Рисунок 54).Уменьшение экспрессии гена цитокининового ответа RR4 в корнях суменьшением экспрессии MtKNOX3 (MtKNOX3-RNAi) согласуется с данными,полученнымивстатьеGiacomo2016приодновременномподавленииMtKNOX3/5/9/10 (MtKNAT3/4/5-like) методом интерференции РНК (Di Giacomo, etal., 2016).
Подавление экспрессии гена MtKNOX3 в отдельности (MtKNOX3RNAi) не вызывало изменения в клубенькообразовании, тогда как одновременноеподавление экспрессии MtKNOX3/5/9/10 приводило к формированию «слитых»клубеньков. Это можно объяснить тем, что функции генов KNOX у Medicago,подобно их ортологам у арабидопсиса, перекрываются, поэтому уменьшениеэкспрессии одного гена будет компенсировано другими генами KNOX. Фенотип«слитых» клубеньков напоминает фенотип efd-мутанта (Vernié, et al., 2008).Авторы показали, что в корнях с подавлением MtKNAT3/4/5-подобных геновпомимо уменьшения экспрессии RR4, также уменьшается экспрессии EFD(предполагаемый активатор RR4).
Эти данные позволили авторам предположить,что регуляторный модуль EFD/RR4 (Vernié, et al., 2008) является возможноймишенью для KNAT3/4/5-подобных транскрипционных факторов при развитиисимбиотических клубеньков (Di Giacomo, et al., 2016).Кроме того, нами была показана активация экспрессии MtKNOX3/5/9 и MtIPT3в листьях в ответ на инокуляцию. Более того, мы показали, что активацияэкспрессии MtKNOX5/9 и MtIPT3 зависит от CLV1-подобной киназы SUNN в124побеге (Azarakhsh, et al., 2018) (См. схему). SUNN-зависимая активацияэкспрессии MtIPT3 в побеге согласуется с активацией экспрессии его ортолога улядвенца.
Таким образом, можно предположить, что регуляторный модульKNOX-IPT/LOG может функционировать не только в меристеме побега, но и вдругих программах развития: в развивающих клубеньках, а также в листьях приактивации системы авторегуляции клубенькообразования (см. Рисунок 54).Кроме того, мы показали, что экспрессия генов MtKNOX регулируется сучастием киназы SUNN не только в побеге, но и в корне. Интересно, чтолокализация экспрессии MtKNOX3 меняется в клубеньках у мутантов sunn-3: вчастности, у мутантов sunn-3 наблюдается экспрессия гена MtKNOX3 в меристемеклубеньков, чего не наблюдали у растений дикого типа. Согласно литературнымданным, в меристеме клубеньков экспрессируется близкий паралог MtKNOX3, генMtKNOX5 (Di Giacomo, et al., 2016, Limpens, et al., 2013, Roux, et al., 2014),функция которого, как предполагается, может перекрываться с функциейMtKNOX3 (Di Giacomo, et al., 2016).
Помимо этого, у мутантов sunn-3 мы ненаблюдали активации экспрессии MtKNOX5 в корнях в ответ на инокуляцию. Мыпредполагаем, что у мутантов sunn-3 отсутствие экспрессии гена MtKNOX5 вклубеньках может приводить к тому, что паралог гена MtKNOX5, MtKNOX3,начинает выполнять его функцию, в результате чего у мутантов sunn-3наблюдается эктопическая экспрессия MtKNOX3 в меристеме клубеньков, где урастений дикого типа экспрессируется ген MtKNOX5.ВозможнаявзаимосвязьТФMtKNOX3скомпонентамисистемыавторегуляции клубенькообразования была исследована через возможное еговлияние на экспрессию генов CLE.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
