Диссертация (1145941), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Также было показано,что у лядвенца синтез цитокинина в побеге происходит за счёт активацииэкспрессии IPT3, и эта активация зависит от CLV1-подобной киназы (Sasaki, et al.,2014).Так как в нашей работе MtIPT3 является предполагаемой мишеньютранскрипционного фактора MtKNOX3, было бы интересно проверить влияниетранскрипционныхфакторовKNOXнаэкспрессиюMtIPT3идругихпредполагаемых мишеней в побеге и изучить возможную роль MtKNOX3 всистеме авторегуляции. Для достижения этой цели, необходимо было преждевсего проанализировать экспрессию генов MtIPT в побеге в ответ на инокуляциюу растений дикого типа и суперклубенькообразующего мутанта, аналогично тому,как это было у лядвенца.3.5.1.1.
Анализ экспрессии генов MtIPT в побеге в ответ на инокуляции урастений дикого типа и суперклубенькообразующего мутанта sunn-3Мы проанализировали экспрессию разных генов MtIPT в листьях на разныедни после инокуляции ризобиями. На основании наших данных экспрессияMtIPT3/4/5 в листьях увеличивается в ответ на инокуляцию, что говорит овозможном участии этих генов в системном контроле. При этом увеличение вразных повторностях наблюдается на разные дни (5 и 7 дпи) (Рисунок 44).
Мыполагаем, что временная динамика развития клубеньков может варьировать взависимости от условий выращивания растений в разных экспериментах, и времяактивации AON может меняться соответственно. Экспрессия других генов MtIPT(MtIPT1,2,9) не увеличивается в листьях в ответ на инокуляцию (приложение 11).109Рисунок 44 - Уровни экспрессии генов MtIPT3,4,5 в листьях в ответ наинокуляцию у растений дикого типа. На рисунке представлены результаты двухбиологических повторностей (А и Б). NI-3d, -5d, -7d, -10d – контроли безинокуляции на соответствующих сроках.Чтобы понять, зависит ли увеличение экспрессии этих генов от AON, вдальнейшеммыпосмотрелиэкспрессиюэтихгеновусуперклубенькообразующего мутанта sunn-3 несущего мутацию в гене CLV1подобой рецепторной киназы, которая необходима для восприятия CLE-пептидови последующего синтеза цитокинина в побеге.Мы показали, что экспрессия MtIPT3 не увеличивается у мутанта sunn-3, чтоуказывает на то, что экспрессия этого гена зависит от SUNN в побеге (Рисунок45).УвеличениеэкспрессииMtIPT4иMtIPT5сохранялосьусуперклубенькообразующего мутанта sunn-3, то есть экспрессии этих генов независит от рецептора SUNN в побеге (Рисунок 45).110Рисунок 45 - Уровни экспрессии генов MtIPT3,4,5 в листьях в ответ наинокуляции у суперклубенькообразующего мутанта sunn-3.
NI-3d, -5d, -7d, -10d –контроли без инокуляции на соответствующих сроках.Таким образом, по аналогии с L. japonicus, у M. truncatula былидентифицирован ген MtIPT3, экспрессия которого увеличивается в листьях вответ на инокуляцию. Кроме того, было показано, что его экспрессия, также какего ортолога у лядвенца LiIPT3. зависит от действия SUNN в побеге.3.5.1.2. Анализ экспрессии генов MtKNOX в побеге в ответ на инокуляции урастений дикого типа и суперклубенькообразующего мутанта sunn-3Для того чтобы показать, что активация экспрессии генов MtIPT в побегеможет быть результатом активации экспрессии транскрипционных факторовKNOX (подобно тому, что наблюдается в клубеньках) необходимо было такжепроанализировать экспрессию всех генов MtKNOX в листьях на разные дни послеинокуляции ризобиями.
В листьях мы наблюдали увеличение экспрессии геновMtKNOX3/5/9 в ответ на инокуляцию, при этом время их активации совпадает сактивацией гена MtIPT3 в разных повторностях (Рисунок 46).111Рисунок 46 - Уровни экспрессии генов MtKNOX3,5,9 в листьях в ответ наинокуляцию у растений дикого типа. На рисунке представлены результаты двухбиологических повторностей (А и Б). NI-3d, -5d, -7d, -10d – контроли безинокуляции на соответствующих сроках.У суперклубенькообразующего мутанта sunn-3 не наблюдается увеличениеэкспрессии MtKNOX5/9 (Рисунок 47). Таким образом, можно предположить, чтоактивация генов MtKNOX5/9 происходит после рецептора SUNN в пути AON, тоесть их экспрессия зависит от SUNN.112Рисунок 47 - Уровни экспрессии генов MtKNOX3,5,9 в листьях в ответ наинокуляцию у суперклубенькообразующего мутанта sunn-3.
NI-3d, -5d, -7d, -10d –контроли без инокуляции на соответствующих сроках.Увеличение экспрессии генов MtKNOX3/5/9 в ответ на инокуляцию в побеге итот факт, что увеличение их экспрессии в разных повторностях совпадает сувеличением экспрессии гена MtIPT3 в листьях, указывает на то что в побеге,также как в корнях, активация экспрессии MtIPT может происходить за счётактивации экспрессии транскрипционных факторов семейства MtKNOX. Такжебыло показано, что активация MtKNOX5/9 и MtIPT3 зависит от компонентовсистемы авторегуляции.
Таким образом активация транскрипционных факторовсемейства MtKNOX после рецепторной киназы SUNN может способствоватьбиосинтезу цитокинина в побеге.3.5.1.3.АнализэкспрессиигеновMtIPTиMtKNOXвкорняхсуперклубенькообразующего мутанта sunn-3Кроме того, мы оценили уровни экспрессии генов MtIPT и MtKNOX в корняхсуперклубенькообразующего мутанта sunn-3. Экспрессия генов MtIPT, а такжеMtKNOX3/9 не меняется в целом у мутанта sunn-3 (Рисунок 48 и Рисунок 49), нопри этом в клубеньках мутанта sunn-3 не наблюдается активации экспрессииMtKNOX5.
Этот факт говорит о возможности контроля активации экспрессии113этого гена, с помощью компонентов системы авторегуляции (Рисунок 49; см.также приложение 13 и 14).Рисунок48-УровниэкспрессиигеновMtIPTвкорняхсуперклубенькообразующего мутанта sunn-3.
(5-21 дни после инокуляции (dpi),NI-5d, NI-7d и NI-10d – контроли без инокуляции).114Рисунок49Уровни-экспрессиигеноввMtKNOXкорняхсуперклубенькообразующего мутанта sunn-3. (5-21 дни после инокуляции (dpi),NI-5d, NI-7d и NI-10d – контроли без инокуляции).3.5.1.4.ЛокальныйанализэкспрессиигенаMtKNOX3усуперклубенькообразующего мутанта sunn-3ДляболеедетальногоанализаэкспрессиигенаMtKNOX3усуперклубенькообразующего мутанта sunn-3, мы трансформировали проросткимутантов sunn-3 с помощью штамма A. rhizogenes (MSU440), содержащегоконструкциюpMtKNOX3:GUS.трансгенныекорнибылиПолученныеподвергнутыпредставлены на рисунке 50.115врезультатетрансформацииGUS-окрашиванию.РезультатыРисунок 50 - Активность промотора MtKNOX3 в клубеньках на разных срокахразвития у суперклубенькообразующего мутанта sunn-3, трансформированного спомощью конструкции pMtKNOX3::GUS.
Масштабная шкала, 100 мкм. Толщинасрезов, 50 мкм.На ранних стадиях развития клубеньков, экспрессия MtKNOX3 наблюдается впримордии клубеньков, затем экспрессия наблюдается в апикальной зонеклубенька и также в месте формирования будущих проводящих тканей подобнотому, как это наблюдали у растений дикого типа. Однако в случае мутанта sunn-3активность GUS распределена не равномерно, а в виде отдельных зон с болееинтенсивным окрашиванием. В зрелых клубеньках у мутанта sunn-3 экспрессияMtKNOX3 наблюдается в меристеме клубеньков, что также не наблюдалось удикого типа (Рисунок 50Й, Г, Ж, К).
Таким образом, у мутантов sunn-3,изменяется характер экспрессии гена MtKNOX3. Можно предположить, чтолокализация экспрессии MtKNOX3 в пределах клубенька регулируется с участиемкиназы SUNN.На основе данных, полученных с помощью Affymetrix GeneChips и RNA-seq(Di Giacomo, et al., 2016, Limpens, et al., 2013, Roux, et al., 2014), MtKNOX5116экспрессируетсявмеристемеклубеньков,тогдакакMtKNOX3/9неэкспрессируется в этой зоне.
В связи с этим возможно, что отсутствие экспрессииMtKNOX5 у мутантов sunn-3 (и тот факт, что функции этих генов могутперекрываться) может приводить к тому, что у мутанта sunn-3, ген MtKNOX3выполняет функцию, которую у дикого типа выполняет ген MtKNOX5, чтоприводит к эктопической экспрессии гена MtKNOX3 в меристеме клубеньков умутанта sunn-3.3.5.2. Изучение влияния подавления экспрессии гена MtKNOX3 с помощьюинтерференции РНК на экспрессию генов CLE, активируемых приклубенькообразованииИзвестно, что CLE-пептиды вовлечены в авторегуляцию, то есть негативнуюрегуляцию развития клубеньков (Okamoto, et al., 2009). У люцерны CLEпептидами, подавляющим клубенькообразование, является CLE12 и CLE13(Mortier, et al., 2010).
Было показано, что экзогенный цитокинин, а такжеувеличение экспрессии LOG1 приводят к увеличению экспрессии CLE13 улюцерны (Mortier, et al., 2014). Из этого следует, что цитокинин также вовлечен всистемный контроль через активацию CLE13.
Так как в ходе выполнения нашейработы мы обнаружили действие транскрипционного фактора MtKNOX3 на геныLOG, представляет интерес изучение связи KNOX-цитокинин-CLE в системномконтроле.3.5.2.1. Анализ экспрессии клубенек-специфичных генов CLE (в т.ч. изучениевлияния нитрата на экспрессию генов CLE)В последнее время в базе данных Medicago truncatula появились ранее неаннотированные гены CLE. В новой версии генома Medicago были обнаруженыпоследовательности CLE, которые являются близкими гомологами симбиозспецифичных CLE-пептидов лядвенца и сои (Medtr2g091120 и Medtr2g091125).Также были обнаружены другие последовательности CLE, экспрессия которых117согласно данным Gene Expression Atlas увеличивается при клубенькообразовании(Medtr2g437800,Medtr2g015445,Medtr4g087850).Мыпроанализировалиэкспрессию этих генов вместе с экспрессии CLE12/13 (которые ранее былиидентифицированы у Medicago) при клубенькообразовании.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
