Диссертация (1145941), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Анализ активности репортерного белкабета-глюкоронидазы втрансгенных тканях растенийАнализ активности промотора проводили с помощью репортерного гена GUS(GUS: β-glucuronidase). В качестве субстрата использовали X-Gluc (5-bromo-4chloro-3-indolylglucuronide)(Sigma-Aldrich,США).Растительныетканиинкубировали в буфере для GUS-окрашивания (NT –буфер: 100 mM Tris/50 mMNaCl; 1,9 мМ K3Fe(CN)6; 2,5 мМ X-Gluc в ДМСО) при 37°C в течение часа.2.16. Получение срезов тканей растенийСрезы тканей растений в 3% агарозе получали с использованием микротома свибрирующим лезвием Leica VT1200S и фотографировали с помощьюинвертированного флуоресцентного микроскопа Leica DMI6000 в ресурсномцентре «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ.2.17.
Создание конструкции для гетерологичной экспрессии KNOX3-CDS иKNOX3-HD в Pichia pastoris, культивирование штаммов-продуцентов,выделение и очистка белкаПоследовательностьгомеобоксагенаMtKNOX3(соответствуетаминокислотам с 359 по 426 из кодирующей области KNOX3), а такжеполноразмернуюкодирующуюобластьKNOX3-CDS(439аминокислот)амплифицировали с помощью полимеразы Phusion (New England Biolabs, cat. no.M0530S).
При амплификации к последовательности прямого праймера былдобавлен сайт рестрикции EcoRI (gaattc), а к обратному праймеру был добавленсайт рестрикции XbaI (tctaga) (HD-For: aggaattcattttacgcaagagacgagc; HD-Rev:gctctagagcagttgaaggattgctgtgc;KNOX3-CDS-For:aggaattcatggcttaccaaaaccaac;KNOX3-CDS-Rev: gctctagagcgttttgagaccttttgcgtttg). Также были добавлены двануклеотида к обратным праймерам, чтобы последовательность кодирующейобласти гена MtKNOX3, а также последовательность гомеобокса MtKNOX3находились в рамке с α-фактором, эпитопом c-myc и 6хНis-tag.
Полученные62фрагменты были клонированы в промежуточном векторе pJET, и затем встроеныв вектор pPICZαA. Полученной конструкцией трансформировали штамм дрожжейP. pastoris X-33. Наращивали биомассу клеток P. pastoris в среде BMGY в течение48 часов. Клетки центрифугировали (5000 об/мин, 10 мин.) и переносили в средуBMMY. Индуцировали синтез белка метанолом в течение 72 часов. Затем клеткицентрифугировали(5000об/мин,10мин.).Среду,содержащуюбелок,концентрировали с помощью фильтров Amicon Ultra-15 (Merck, cat. no.UFC901008).
Выделение и очистку гомеодомена MtKNOX3 осуществляли спомощью Ni-NTA агарозы (QIAGEN, Ni-NTA Spin kit, cat. no. 31314).Среда BMGY - 1 литр: 1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 100 mM калийфосфатный буфер, pH 6.0 1.34% YNB (yeast nitrogen base, Sigma, cat. no. Y06261KG), 4 × 10-5% биотин, 1% глицерин.Среда BMMY- 1 литр: 1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 100 mM калийфосфатный буфер, pH 6.0 1.34% YNB, 4 × 10-5% биотин, 0.5% метанол.2.18. Анализ сдвига электрофоретической подвижности (англ.
EMSA:Electrophoretic Mobility Shift Assay)БиотинилированныепоследовательностиДНКдлиной40п.о.былисинтезированы в фирме Beagle (http://www.biobeagle.com/ru). Реакцию отжигапроводили в 50 мкл реакционной смеси с 2X буфера для отжига (20mM TrisOH,100mM NaCl, 2mM EDTA) в термоциклере (98 ° С в течение 5 мин, затемпонижали температуру с 97 ° С до 24 ° С (на каждой стадий температурауменьшается на 1 ° С в течение одной минуты), затем поддерживали температуруна 24 ° С в течение 30 мин, затем держали на 4 ° С).10 фмоль/мкл биотинилированной двухцепочечной ДНК инкубировали с 0.5до 8 мкг белка с помощью LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (ThermoScientific, 20148)» в буфере для связывания EMSA (100mM Tris, 500mM KCl,10mM DTT; pH 7.5) вместе с Poly dI-dC (1μg/μL in 10mM Tris, 1mM EDTA; pH7.5) и 50% Glycerol. ДНК и белок инкубировали в течение часа при комнатной63температуре.Припроведенииконкурентногоанализанемеченнуюдвухцепочечную ДНК добавляли в 2000-кратном избытке, по сравнению смеченной ДНК.
Реакции связывания разделяли на 10% полиакриламидном геле(соотношение акриламида к бис-акриламиду 29: 1) и 3% глицерина) в 0,5X Трисборат-EDTA буфере. После электрофореза, переносили ДНК на мембрану(Biodyne B Nylon Membrane, 8cm × 12cm, 0.4μm pore size, Thermo Scientific 77016)с помощью блота (Mini Trans-Blot cell, BioRad, США). Биотинилированную ДНКнамембранедетектировалиспомощьюхемилюминесценции(Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit (Thermo Scientific, 89880) сиспользованием прибора GeneGnome (SynGene).2.19. Анализ взаимодействия с помощью технологии поверхностногоплазмонного резонанса (англ.
SPR: surface plasmon resonance)Взаимодействия между биотинилированными олигонуклеотидами (лиганд) иочищенным белком (аналит-гомеодомен MtKNOX3) оценивали с помощьютехнологии поверхностного плазмонного резонанса с использованием прибораProteOn XPR36 (Bio-Rad) в ресурсном центре «Развитие молекулярных иклеточныхтехнологий»СПбГУ.Биотинилированныйдвухцепочечныйолигонуклеотид с концентрацией 0,5-1µM в PBS/tween (pH 7.4) иммобилизовалина сенсорном микрочипе, который был покрыт нейтравидином (ProteOn NLCsensor chip, Bio-Rad) при скорости потока (flow rate) 30µl/min.
Взаимодействиеоценивали при разных концентрациях белка (0, 1, 3, 5, 7 и 10 µM, белок былразведён в PBS/Tween). В качестве реакционного буфера (running buffer)использовали PBS/Tween. В качестве конкурента, в раствор белка был добавленнемеченный двухцепочечный pol. AT в 10-30-кратном избытке, по сравнению симмобилизированным олигонуклеотидом. Чтобы предотвратить неспецифическоесвязывание в раствор белка также добавляли BSA (A9418, sigma aldrich) сконцентрации670мкг/мл.Данныебылиполученысиспользованиемпрограммного обеспечения ProteOn (ProteOn manager software), и кинетический64анализ проводили с использованием модели оценки langmuir (Langmuir, 1916 и1918).2.20. Обработка растений нитратомПроростки растении выращивали в течение 7 дней на среде Farhaeus и затемрастения пересаживали в гидропонную систему, содержащую среду Soli (Blondon,1964) без нитрата на 4 дня.
После этого растения обрабатывали 10mM KNO3 втечение 24ч..2.21. Компьютерные программы и статистические методы, используемые вработеВыравниваниеиспользованиемнуклеотидныхпрограммыVectorпоследовательностейNTIAdvance10проводили(InforMax,сInchttp://www.informaxinc.com) с помощью алгоритма Clustal W (Thompson et al.,1994 (Thompson, et al., 1994).Для филогенетического анализа, нуклеотидные последовательности M.truncatulaиA.thalianaбыливзятыизбазыданныхphytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/), а нуклеотидные последовательности L. japonicusбыливзятыизбазыGenbankNCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).Последовательности генов выравнивали в программе MEGA6 с использованиемалгоритма Clastal W.
Филогенетическое дерево строили с использованием методамаксимального подобия на основе модели Tamura-Nei (Hall, 2013, Tamura and Nei,1993) с величиной выборки при бутстрэп-анализе (bootstrap value), равной 1000.СтатистическуюобработкупроводилиспомощьюпакетапрограммSTATISTICA 6.0. Сравнения значений длины корня и числа клубеньков на корняхс RNAi гена MtKNOX3 использовали t-критерий Стьюдента.
Уровни экспрессиигенов в контрольных корнях и в корнях с измененной экспрессией MtKNOX3 итакже при обработке нитратом сравнивали с помощью однофакторногодисперсионного анализа (one-way ANOVA).65Статистический анализ в экспериментах по РНК-интерференции MtKNOX3,был сделан с учётом 8-10 биологических повторностей, в спонтанных клубенькахс учётом 5 биологических повторностей и при обработке нитратом в 3биологических повторностях.66Глава 3.
Результаты и обсуждение3.1. Анализ экспрессии генов семейства KNOX при клубенькообразовании3.1.1. Количественный анализ экспрессии генов MtKNOX на разных стадияхразвитии клубеньков3.1.1.1. Анализ последовательностей генов MtKNOX в базах данных, подборпраймеровРанее в геноме Medicago truncatula были идентифицированы десять генов изсемейства KNOX (Di Giacomo, et al., 2008, Zhou, et al., 2014). Последовательностипраймеров к генам MtKNOX1-6 были взяты из статьи Джиакомо и соавторов (DiGiacomo, et al., 2008), к остальным генам MtKNOX (MtKNOX7-10) былиподобраны праймеры (см. приложение 1). При ПЦР с данными праймерами наматрице геномной ДНК люцерны были получены фрагменты ожидаемого размера(Рисунок 11).Рисунок 11 - ПЦР с праймерами к генам MtKNOX на матрице ДНК. MW – Маркермолекулярного веса, 1- MtKNOX1, 2-MtKNOX2, 3-MtKNOX3, 4-MtKNOX4, 5MtKNOX5, 6-MtKNOX6, U- ubiquitin.На следующем этапе мы проанализировали экспрессию генов MtKNOX 1-6 впримордиях клубеньков на 7 день после инокуляции (дпи).
Было обнаружено, чтоэкспрессия гена MtKNOX3 активируется в ответ на инокуляцию, по сравнению сконтролем (Рисунок 12).67Рисунок 12 - Экспрессия генов MtKNOX в примордиях клубеньков на 7 деньпосле инокуляции. 1- MtKNOX1, 2-MtKNOX2, 3-MtKNOX3, 4-MtKNOX4, 5MtKNOX5, 6-MtKNOX6, U- ubiquitin.3.1.1.2. Анализ экспрессии генов MtKNOX на разных стадиях развитииклубеньков с помощью количественной ПЦР в реальном времениДля более детального анализа экспрессии генов MtKNOX при развитииклубенька мы оценили уровень их экспрессии на разные дни после инокуляции(дпи, англ.
dpi, days post inoculation) с помощью количественной ПЦР в реальномвремени (Рисунок 13 и см. Приложение 1). Результаты этого эксперимента такжепоказали активацию экспрессии гена MtKNOX3 в ответ на инокуляцию. На 7 дпимы наблюдали увеличение экспрессии гена MtKNOX3, по сравнению с контролем.На последующих этапах экспрессия гена MtKNOX3 возрастала, достигаламаксисмума на 12 дпи (в среднем более 40 раз, по сравнению с контролем).
На 1522 дпи экспрессия гена MtKNOX3 несколько снижалась.68Рисунок 13 - Уровни экспрессии гена MtKNOX3 на разных сроках развитияклубеньков (3-22 дни после инокуляции (dpi), NI-5d и NI-7d – контроли безинокуляции).Кроме того, наблюдали небольшое, по сравнению с MtKNOX3, увеличениеэкспрессии MtKNOX5 и MtKNOX9 в ответ на инокуляцию. Экспрессия другихпроанализированных генов MtKNOX (MtKNOX 1,2,4,6,7,8,10) в ответ наинокуляцию значительно не изменялась (см. Приложение 1).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
