Диссертация (1145941), страница 13
Текст из файла (страница 13)
У арабидопсиса AtLOG представляет собой семейство генов из 9представителей. На основании данных активности GUS, было показано, чтоLOG1,2,3,4,5,7,8 экспрессируются в корнях (Kuroha et al., 2009), именно ихпоследовательности и были использованы для поиска предполагаемых гомологоввгеномеM.truncatula,соответствующиелокусамподMedtr7g101290,Medtr1g064260, Medtr4g058740, Medtr3g113710, Medtr1g105240, Medtr1g015830,78Medtr1g024850, Medtr3g041540 (Рисунок 21). В дальнейшем часть из этихпоследовательностей будут названы в соответствие с нумерацией, которые даныим в статье Mortier et al., 2014, то есть Medtr7g101290 как MtLOG1, Medtr1g064260как MtLOG2, Medtr4g058740 как MtLOG3, Medtr3g113710 как MtLOG4,Medtr1g105240 как MtLOG5 и Medtr1g015830 как MtLOG6.Рисунок 21 - Дерево, иллюстрирующее степень сходства последовательностейгенов AtLOG1,2,3,4,5,7,8 (выделены красной рамкой) с последовательностями ихпредполагаемых гомологов у Medicago truncatulа.К выбранным последовательностям, кодирующим гомологи LOG у M.truncatula, были подобраны праймеры для последующего анализа экспрессиигенов (см.
Приложение 15).3.2.4. Анализ экспрессии генов MtLOG на разных стадиях развитииклубеньков с помощью количественной ПЦР в реальном времениМы проанализировали экспрессию генов MtLOG на различных этапахразвития клубенька и обнаружили активацию экспрессии MtLOG1, MtLOG2 иMtLOG3 (Рисунок 22). Данные по активации экспрессии двух из этих генов −MtLOG1 и MtLOG2 − в ходе развития клубенька согласуются с даннымиопубликованного исследования Mortier и соавторов (Mortier, et al., 2014).79Рисунок 22 - Уровни экспрессии генов MtLOG1(А), MtLOG2(Б), MtLOG3(В) наразных сроках развития клубеньков (3-22 дни после инокуляции (dpi), NI-5d и NI7d – контроли без инокуляции).Таким образом, мы обнаружили изменение экспрессии в ходе развитияклубенька ряда генов семейств MtIPT и MtLOG, вовлеченных в биосинтезцитокинина, которые могут обуславливатьувеличение свободныхформцитокинина, необходимых для развития симбиотического клубенька.
Наследующем этапе работы для изучения возможной связи с действием ТФ KNOX3экспрессия этих генов была проанализирована в трансгенных корнях сизмененным уровнем экспрессии гена MtKNOX3.803.3. Изучение роли гена MtKNOX3 с помощью изменения уровня экспрессииэтого гена в трансгенных корнях3.3.1. Изучение влияния сверхэкспрессии гена MtKNOX3 на развитиеклубеньковДля изучения роли гена MtKNOX3 в развитии клубеньков и для выявленияпредполагаемых мишеней их действия нами были созданы генетическиеконструкции для сверхэкспрессии гена MtKNOX3 люцерны.3.3.1.1.Созданиевекторов,трансформациярастенийполученнымиконструкциями с помощью A. rhizogenesМы амплифицировали кодирующие области гена MtKNOX3 M. truncatula отATG до стоп-кодона с использованием следующих праймеров (подчеркнуты attB– сайты для последующего клонирования в вектор pDONOR221):MtKNOX3_CDS_attB1_forAAAAAAGCAGGCTTCATGGCTTACCAAAACCAACATCTMtKNOX3_CDS_attB2_revCAAGAAAGCTGGGTTCTAGTTTTGAGACCTTTTGCGTTTПолученныефрагментыбыликлонированыввектореpDONOR221(Invitrogen).
На рисунке 23 приведены результаты ПЦР на матрице плазмиднойДНК, подтверждающие наличие целевых вставок. Правильность встраивания ввектор была подтверждена путем секвенирования.81Рисунок 23 - ПЦР на матрице плазмидной ДНК с праймерами к генам: MWМаркёр молекулярного веса; 1-KNOX3-2(1); 2-KNOX3-2(2); 3-KNOX3-8; 4KNOX3-8(2).В дальнейшем мы переклонировали кодирующие области гена MtKNOX3 ввектор для сверхэкспрессии pB7WG2D с помощью LR-клоназной системы. Схемавектора приведена на рисунке 24. В итоговом векторе кодирующая область геновнаходится под контролем промотора и терминатора гена 35S вируса табачноймозаики.Правильность клонирования проверяли с помощью рестрикционного анализас использованием рестриктазы EcoRV (Рисунок 25).Рисунок 24 - Схема вектора pB7WG2D.82Рисунок 25 - А и Б: Размеры фрагментов рестрикции, получаемых при обработкевектора pB7WG2D без вставки (А) и со вставкой кодирующей области генаMtKNOX3 (Б) с помощью рестриктазы EcoRV.
В: Рестрикционный анализ вектораpB7WG2DсовставкойкодирующихобластейMtKNOX3.MW-Маркёрмолекулярного веса; 1.-MtKNOX3+pB7WG2D/EcoRV; 2. pB7WG2D/EcoRV.Размеры полученных фрагментов рестрикции совпадают с ожидаемыми.Исходя из этого, мы сделали вывод, что фрагменты кодирующих областейклонированы в вектор в правильном положении и в нужной ориентации.Таким образом, нами были получены конструкции для сверхэкспрессии генаMtKNOX3.Вдальнейшемполученнаяконструкция35S:MtKNOX3былаиспользована для трансформации люцерны с помощью A.
rhizogenes, в результатекоторой были получены трансгенные корни со сверхэкспрессией MtKNOX3(Рисунок 26).83Рисунок 26 - Свечение GFP у растений со сверхэкспрессии MtKNOX3. СвечениеGFP обусловлено наличием во фрагменте Т-ДНК, переносимом в геном растенияпри трансформации, конструкции 35S-GFP-T35S для отбора трансгенных корней.Для проверки уровня экспрессии гена MtKNOX3 в трансгенных корнях былиподобраны праймеры для кодирующей области гена MtKNOX3:MtKNOX3_FOR:ACTCACCCGACCCTAACTCCAAMtKNOX3_REV:AACAACCGCCACCTCACTCTTTУвеличение экспрессии гена MtKNOX3 в трансгенных корнях и клубеньках посравнениюсконтролем(GUS_OE)былоподтвержденоколичественной ПЦР в реальном времени (Рисунок 27).84спомощьюРисунок 27 - Подтверждение сверхэкспрессии гена MtKNOX3 в корнях (А) иклубеньках (Б) на стадии 12 дпи люцерны с помощью количественной ПЦР вреальном времени.В трансгенных корнях, содержащих конструкцию для сверхэкспрессииMtKNOX3 (KNOX3-OE) уровень экспрессии был увеличен от 120 до 475 раз посравнению с контролем (GUS-OE) (Рисунок 27А).
При этом в трансгенныхклубеньках KNOX3-OE увеличение экспрессии гена MtKNOX3, по сравнению склубеньками GUS-OE было выражено в меньшей степени и составляло от 10 до40 раз (Рисунок 27Б). Вероятно, это связано с тем, что, согласно нашим данным, вклубеньках на 12 дпи уровень экспрессии гена MtKNOX3 возрастает, посравнению с неинокулированными тканями корня, в том числе и в клубеньках сосверхэкспрессией GUS (GUS-OE). В связи с этим разница в уровнях экспрессиигена MtKNOX3 между клубеньками GUS-OE и KNOX3-OE выражена в меньшейстепени, чем в тканях корней GUS-OE и KNOX3-OE.85Такимобразом,мыпоказали,чтовкорнях,трансформированныхконструкцией KNOX3-OE, действительно наблюдается увеличение уровняэкспрессии гена MtKNOX3, по сравнению с контролем (GUS-OE).3.3.1.2.ОценкавлияниясверхэкспрессиигенаMtKNOX3наклубенькообразованиеВ первом опыте мы отметили, что на корнях, сверхэкспрессирующихMtKNOX3, образовывались клубеньки без инокуляции ризобиями.
Поскольку вэтомопыте не соблюдали стерильность, этомоглобыть результатомпереинокуляцией ризобиями. Для проверки того, могут ли действительнообразовываться спонтанные клубеньки на корнях со сверхэкспрессией MtKNOX3,мыповторилиопытвстерильныхусловиях:растениявыращиваливпроавтоклавированных горшках, в стерильном вермикулите в световом шкафу. Вотсутствииризобийнатакихрастенияхмыобнаружилиструктуры,напоминающие примордии клубеньков или аномальные боковые корни (округлойформы) (Рисунок 28А-В).86Рисунок 28 - Клубенькоподобные структуры на трансгенных корнях сосверхэкспрессией MtKNOX3.
А, Б, B – общий вид клубенькоподобных структур(показаны стрелками) на корнях со сверхэкспрессией MtKNOX3. ФлуоресценцияGFP (A и Б) подтверждает трансгенную природу корней. Г, Д - поперечный (Г) ипродольный (Д) срезы спонтанных клубеньков с одним проводящим пучком. Длясравнения приведены поперечный срез нормального клубенька, индуцированногоризобиями, с периферическими проводящими пучками (Е) и поперечный срезпримордия бокового корня (Ё). Масштабная шкала - 100 мкм.
Толщина срезов, 50мкм.Анализ срезов показал, что обнаруженные нами структуры действительнопредставляют собой структуры округлой формы, в которых видно увеличениеслоев клеток коры, что не характерно для примордиев боковых корней.Микроскопический анализ показал, что эти структуры появились в результатеклеточных делений, противоположных полюсу протоксилемы (Рисунок 28Г). Вотличие от нормальных клубеньков, индуцированных ризобиями, в таких87структурах не формируется периферическая проводящая систему, а вместо этогонаблюдается один центральный проводящий пучок, как это характерно дляпримордиев боковых корней (Рисунок 28Г, Е и Ё). Таким образом, образующиесяструктуры на корнях KNOX3-OE напоминают примордии клубеньков илипримордии боковых корней с измененным характером делений клеток коры.Для того, чтобы понять какую природу имеют наблюдаемые нами структуры,мы проанализировали экспрессию гена MtNIN, который как было показано ранееэкспрессируется только в клубеньках и имеет значительно более низкий уровеньэкспрессии в примордии боковых корней (Guan, et al., 2013).
Экспрессия генаMtNINбылазначительновышевклубенькоподобныхструктурах,формирующихся на корнях со сверхэкспрессии MtKNOX3, по сравнению спримордиями боковых корней (Рисунок 29А). Полученные результаты указываютна то, что наблюдаемые структуры отличаются от примордиев боковых корней иимеют клубенькоподобную природу.Спонтанныеклубенькинаблюдалиранеенабобовыхрастенияхсконститутивной активностью гена рецептора цитокинина (Tirichine, et al., 2007).Чтобы проверить предположение о том, что клубенькоподобные структуры могутразвиваться в результате накопления цитокинина на корнях со сверхэкспрессиейMtKNOX3, в этих структурах был проанализирован уровень экспрессии генацитокининовогозначительноответавышевMtRR4.Действительно,клубенькоподобныхэкспрессияструктурах,поMtRR4быласравнениюсклубеньками, индуцированными ризобиями, образующихся на корнях сосверхэкспрессией GUS (клубеньки на корнях со сверхэкспрессии GUS былисобраны на 12 дпи) (Рисунок 29Б).88Рисунок 29 - Уровни экспрессии клубенек-специфичного гена MtNIN вспонтанных клубеньках (SN: spontaneous nodule), в клубеньках, индуцированныхризобиями (RIN: rhizobium-induced nodules) и в примордиях боковых корней (LR:lateral roots) (А).
Уровень экспрессии MtRR4 в спонтанных клубеньках (SN) и вклубеньках, индуцированных ризобиями (RIN) (Б).Образование структур, напоминающих примордии клубеньков на корняхKNOX3-OE в отсутствии инокуляции ризобиями (т.е. спонтанно), можетсвидетельствовать об участии ТФ KNOX3 в регуляции делений клеток коры,необходимых для формирования клубеньков. Из литературных данных известно,что локальное усиление концентрации цитокинина у арабидопсиса, вызванноесверхэкспрессией гена биосинтеза цитокинина IPT в клетках перицикла, дающихначало примордиям боковых корней, нарушает закладку примордиев боковыхкорней; более того, экзогенное добавление цитокинина вызывает изменениенаправлений клеточных делений в формирующемся примордии, нарушая егоструктуру, что приводит к формированию «плоского» примордия боковых корней(Laplaze, et al., 2007).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
