Диссертация (1145941), страница 15
Текст из файла (страница 15)
На рисунке 38 показано схематическоеизображение структуры генов MtLOG1, MtLOG2, MtIPT3, MtIPT5 и такжеместоположение предполагаемых сайтов-мишеней на них.100Рисунок 38 - Схематическое изображение структур генов MtLOG1, MtLOG2,MtIPT3, MtIPT5 и также место положение предполагаемых сайтов-мишеней наних.3.4.2. Наработка гомеодомена ТФ MtKNOX3 в гетерологичной системе дляпоследующего анализа его связывания с последовательностями-мишенями(Создание конструкции, трансформация дрожжей P. pastoris, наработка иочистка белка)Для изучения связи ТФ MtKNOX3 с промотором предполагаемых геновмишеней, прежде всего, необходимо было синтезировать белок.
Для этого мыиспользовали метилотрофные дрожжи P. pastoris. Нами были амплифицированыкодирующая область гена MtKNOX3, а также последовательность, кодирующаягомеодомен MtKNOX3. Эти последовательности были сначала клонированы впромежуточный вектор pJET, а затем в вектор pPICZαA (Рисунок 39). ВекторpPICZαA используется для гетерологичной экспрессии в дрожжах P. рastoris исодержит промотор AOX1, который индуцируется метанолом и позволяетподдерживать высокий уровень экспрессии гена интереса в P.
рastoris. Также вэтом векторе присутствует последовательность α-фактора, который необходимдля секреции белка, последовательность c-myc, которая позволяет детектировать101рекомбинантный белок с помощью антител к c-myc, а также последовательностьhis-tag облегчающая последующую очистку. Кодирующая последовательностьMtKNOX3 и гомеодомена были встроены в рамку с α-фактором, c-myc и his-tag.Полученной конструкцией трансформировали штамм X-33 дрожжей P.
pastoris.Этот вектор интегративный и поэтому интегрируется в геном P. pastoris.Рисунок 39 - Схема вектора pPICZα.Дляпроверкиполученныхтрансформантовизнихбылавыделенахромосомная ДНК P. рastoris. Наличие необходимых конструкций былоподтверждено с помощью ПЦР и секвенирования (Рисунок 40).102Рисунок 40 - Подтверждение наличия вставок в конструкции, содержащиекодирующую область MtKNOX3 (MtKNOX3-CDS) и гомеодомен MtKNOX3(MtKNOX3-HD).На следующем этапе мы наращивали биомассу клеток P. pastoris, затеминдуцировали синтез белка метанолом и анализировали среды на наличиесекретированного белка с помощью белкового электрофореза и Вестерн-блота.Показали, что гомеодомен MtKNOX3 синтезируется и секретируется в P. pastoris(Рисунок 41). Однако, полноразмерный белок MtKNOX3 в среде не былобнаружен.Мы проводили дот-блот анализ сред после культивирования трансформантовP. pastoris, содержащих полноразмерные последовательности MtKNOX3 и лизатовклеток.
Показали, что белок в небольших количествах присутствует в клеточныхлизатах, но не в среде после культивирования (приложение 7). Очевидно, чтобелок MtKNOX3 не секретируется в среду. Возможно, это связано с тем, что внём присутствуют последовательности, которые препятствуют его секрецииклетками P. pastoris.103Рисунок 41 - Результаты белкового электрофореза (слева) и вестерн блота(справа) образцов сред после культивирования штамма-продуцента и послеочистки белка.
1 - среда после культивирования исходного штамма X-33, 2- средапосле культивирования штамма-продуцента MtKNOX3-HD, 3- белок послеочистки, 4- маркер.Дальше мы приступили к наработке и очистке гомеодомена MtKNOX3 спомощью Ni-NTA Agarose-QIAGEN (Ni-NTA Spin Column Purification of6xHisTagged Proteins under Native Conditions from E. coli Cell Lysates (cat. no.31314)).Выделенный гомеодомен MtKNOX3 был использован для дальнейшихэкспериментов, т.е. для изучения связывания гомеодомена MtKNOX3 спредполагаемыми последовательностями-мишенями с помощью методов EMSA иSPR.1043.4.3. Изучение связывания гомеодомена ТФ MtKNOX3 с предполагаемымисайтами-мишенями3.4.3.1.Изучениесвязыванияпоследовательностями-мишениямигомеодоменаспомощьюMtKNOX3анализассдвигаэлектрофоретической подвижности (Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)Метод оценки сдвига электрофоретической подвижности (Electrophoreticmobility shift assay, EMSA) также называемый gel shift assay, gel mobility shiftassay, band shift assay или gel retardation assay) используется для изучениявзаимодействия белок-ДНК или белок-РНК.
На первом этапе создаются условиядля взаимодействия in vitro, а затем проводят электрофорез в полиакриламидномгеле, при этом взаимодействие белок-ДНК выявляют на основании задержки вгеле комплекса ДНК-белок по сравнению со свободной ДНК. ПоследовательностиДНК-мишени были мечены биотином, что делает возможной визуализацию ДНКс помощью хемилюминесценции (Chemiluminescent Nucleic Acid Detection ModuleKit (Thermo Scientific, 89880)).
Как дополнительный контроль используетсянемеченая ДНК в большом избытке, по сравнению с меченой ДНК. Меченая ДНКбудет выглядеть как свободная ДНК и таким образом можно понять, что белоксвязывается именно с ДНК а не с биотином (См. материалы и методы).С помощью этого метода удалось показать взаимодействие гомеодоменаMtKNOX3 с последовательностью из первого интрона гена MtLOG1 и также споследовательностямивпромоторегеновMtLOG2иMtIPT3ипоследовательностью из последнего интрона гена MtIPT5 (последовательностиLOG1, LOG2-1, IPT3-1 и IPT5). Все эти последовательности содержат два илиболее полных мотивов TGAC (Рисунок 42).
Также было показано взаимодействиедля гомеодомена MtKNOX3 и последовательностей LOG2-2, IPT3-2, IPT3-3(приложение 8 и 9). В качестве отрицательного контроля была использованапоследовательность poly A-T, для которой не было показано взаимодействия(приложение 10).105Рисунок 42 - Результаты EMSA с использованием гомеодомена MtKNOX3 ирегуляторных последовательностей из генов MtLOG1 (А), MtLOG2 (Б), MtIPT3 (В)и MtIPT5 (Г), содержащий два или более мотива TGAC. 1. БиотинилированнаяДНК, 2-6. Биотинилирлванная ДНК вместе с разными концентрациями белка(MtKNOX3-HD): 8, 4, 2, 1 или 0.5 мкг, сответственно), 7. БиотинилированнаяДНК вместе с 2 мкг белка и 2000x немеченая ДНК (конкурент).3.4.3.2.ИзучениесвязываниягомеодоменаMtKNOX3споследовательностями-мишениями с помощью метода на основе ППР(поверхностный плазмонный резонанс, анг. SPR) с использованием системыProteONДанныйподходпозволяетвыявитьналичиемежмолекулярныхвзаимодействий, а также позволяет получить информацию по аффинности икинетике взаимодействий, то есть константу ассоциации и диссоциации (Ritzefeldand Sewald, 2012, Teh, et al., 2007).106Для оценки взаимодействия с помощью ППР (англ.
SPR) использовали приборProteOn XPR36 (http://biomed.spbu.ru/equipment/list/biorad_proteon_xpr36.php).Для проведения данного эксперимента биотинилированную двухцепочечнуюДНК (LOG1, LOG2-1, IPT3-1 и IPT5) иммобилизовали на чипе, покрытомнейтравидином (NLC sensor chip, bio-rad) и кинетику взаимодействия оценивалипри разной концентрации гомеодомена MtKNOX3 (Рисунок 43). Таблица 2показывает данные по кинетике взаимодействия для каждой последовательностии также для отрицательного контроля polyA-T (См. также приложение 10).Большое значение константы ассоциации и низкое значение константыдиссоциации указывают на высокое сродство гомеодомена MtKNOX3 к этимипоследовательностями, что согласуется с результатами, полученными с помощьюметода EMSA.Рисунок 43 - Сенсограммы, показывающие взаимодействие гомеодоменаMtKNOX3 с регуляторными последовательностями генов MtLOG1 (А), MtLOG2(Б), MtIPT3 (В) и MtIPT5 (Г), содержащими два или более мотива TGAC.
RU:Response Unit (единица резонанса).107Таблица 2 - Данные по кинетике взаимодействия между HD MtKNOX3 ирегуляторными последовательностями генов MtLOG1, MtLOG2-1, MtIPT3-1 иMtIPT5. Ka: константа ассоциации, Kd: константа диссоциации, KD: константаравновесия, RU: Response Unit (единица резонанса).Анализ взаимодействия с помощью двух методов EMSA и SPR и такжерезультаты РНК-интерференции MtKNOX3 указывает на то что, гены MtLOG1/2 иMtIPT3/5 могут быть прямыми мишенями транскрипционного фактора MtKNOX3Таким образом MtKNOX3 может активировать продукцию цитокинина приразвитии азотфиксирующих клубеньков, подобно тому как это описано для ТФSTM и KNAT1 в апикальной меристеме побега (Yanai, et al., 2005).3.5.
Исследование взаимосвязи ТФ MtKNOX3 с компонентами системыавторегуляции клубенькообразования (AON) – CLV1-подобной киназойMtSUNN и CLE-пептидами3.5.1.ИзучениеэкспрессиигеновMtKNOXиMtIPTусуперклубенькообразующего мутанта sunn-3 (в т.ч. локальный анализэкспрессии MtKNOX3)Авторегуляцияклубенькообразованияпредставляетсобоймеханизм,регулирующий число образующихся клубеньков на уровне целого растения.
AONвключает обмен сигналами между корнем и побегом, при этом поступающие изтканей корня CLE-пептиды связываются с CLV1-подобными рецепторами, что108вызывает активацию другого сигнала, который поступает из побега в корень иподавляет образование клубеньков (Okamoto, et al., 2009).Известно,чтогормонцитокининпозитивнорегулируеторганогенезклубеньков. Однако, недавно было показано, что цитокинин так же вовлечён всистему авторегуляции клубеньков (AON): синтезируемый в побеге цитокининпоступает в корень и подавляет образование клубеньков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
