Диссертация (1145941), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Кроме того, известно, что мутация с приобретениемфункции в гене цитокининового рецептора LHK1 у L. japonicus (spontaneousnodule formation 2, snf2), приводит к образованию клубеньков в отсутствиеризобий (спонтанное клубенькообразование) (Tirichine, et al., 2007). Совсем89недавно у лядвенца было показано, что сверхэкспрессия генов пути биосинтезацитокинина (LjIPT3, LjLOG4 и CYP735A) приводит к образованию слитыхспонтанных клубеньков (Reid, et al., 2017). В совокупности, эти данныеуказывают на то, что цитокинин является достаточным для изменения планаделений клеток примордия боковых корней и усиление его концентрации/ответа втканях корня приводит к усилению пролиферацию клеток коры, и как следствие –к образованию спонтанных клубеньков. Кроме того, нами было показаноувеличение экспрессии гена MtRR4 в этих клубенькоподобных структурах.
Всвязи с этим мы предполагаем, что наблюдаемые нами структуры, образующиесяна корнях со сверхэкспрессией MtKNOX3, могут быть связаны с действиемцитокинина, т.е. с увеличением активных форм цитокинина в таких трансгенныхкорнях. Полученный результат свидетельствует в пользу нашей гипотезы овозможном участии MtKNOX3 в активации экспрессии генов метаболизмацитокинина в ходе развития симбиотического клубенька.3.3.1.3. Оценка уровня экспрессии симбиоз-индуцируемых генов MtIPT иMtLOG в спонтанных клубеньках (клубенькоподобных структурах)На следующем этапе, мы проанализировали экспрессию индуцируемых присимбиозе генов MtIPT и MtLOG в спонтанных клубеньках, формирующихся накорнях со сверхэкспрессией MtKNOX3.
В качестве контроля использоваликлубеньки,индуцированныеризобиями,формирующиесянакорняхсосверхэкспрессией GUS (эти клубеньки были собраны на 12 дпи). Полученныерезультаты показывают увеличение экспрессии MtLOG2 и MtIPT3 по сравнению сконтролем. При этом экспрессия других проанализированных генов неувеличивается (Рисунок 30).90Рисунок 30 - Увеличение уровней экспрессии симбиоз-индуцированных геновMtIPT и MtLOG в спонтанных клубеньках (SN: Spontaneous Nodules),формирующихся на корнях со сверхэкспрессией MtKNOX3 по сравнению синдуцированными ризобиями клубеньками (RIN: Rhizobium Induced Nodules),формирующихся на корнях со сверхэкспрессией GUS.Увеличение экспрессии MtLOG2 и MtIPT3 в спонтанных клубенькахпоказывает, что образование этих структур на корнях со сверхэкспрессиейMtKNOX3, действительно может быть связано с увеличением активных формцитокинина в таких трансгенных корнях и ТФ MtKNOX3 может быть вовлечён вактивацию цитокининого ответа при развитии таких структур.3.3.2.
Изучение влияния искусственного подавления экспрессии генаMtKNOX3 с помощью интерференции РНК на развитие клубеньков иэкспрессию предполагаемых генов –мишеней (MtIPT, MtLOG)Для изучения роли гена MtKNOX3 при развитии симбиотических клубеньков,была создана конструкция для подавления экспрессии этого гена через механизминтерференции РНК.913.3.2.1.Созданиевекторов,трансформациярастенийполученнымиконструкциями с помощью A. rhizogenesДля того, чтобы специфично подавить экспрессию гена MtKNOX3 вконструкции были использованы участки гена MtKNOX3, которые не имеютсходства с последовательностями других генов KNOX у Medicago truncatula(Рисунок 31).
При амплификации последовательности к прямому праймеру быладобавлена последовательность CACC, что позволило клонировать выбранныефрагменты с правильной ориентацией в векторе pENTR-D-TOPO (Рисунок 32).MtKNOX3i_1_FORCACCATGGCTTACCAAAACCAACATCMtKNOX3i_151_REVTTGGTTATTAGGGTCGGAATCAMtKNOX3i_189_FORCACCTCGTACCCACTACACCGACAMtKNOX3i_ 294_REVTTTAGAAAATTAGAAGCTCCGTTACCРисунок 31 - Схема расположения фрагментов, использованных в конструкциидля РНК-интерференции гена MtKNOX3.92Рисунок 32 - ПЦР на матрице плазмидной ДНК (подтверждение наличие вставокв векторе pENTR-D-TOPO); MW- Маркёр молекулярного веса; 1 и 2 -KNOX3i_2; 3и 4 -KNOX3i_8.Правильностьвстраиванияввекторбылаподтвержденапутемсеквенирования. В дальнейшем мы переклонировали эти фрагменты в вектор дляРНК-интерференции (pK7GWIWG2D, VIB-UGent, Бельгия) с помощью LRклоназной системы. Схема этого вектора проведена на рисунке 33.Рисунок 33 - Схема вектора pK7GWIWG2D.Правильность клонирования проверяли с помощью рестрикционного анализас использованием рестриктаз BamH1 (Рисунок 34).93Рисунок 34 - А и Б: Размеры фрагментов рестрикции, получаемых при обработкевектора pK7GWIWG2D без вставки (А) и со вставкой (Б) с помощью рестриктазаBamH1.
В: Рестрикционный анализ вектора pK7GWIWG2D с вставкой с помощьюрестриктаза BamH1; MW- Маркёр молекулярного веса; 1 и 2 - KNOX3i_2+pK7GWIWG2D; 3 и 4 -KNOX3i_8+ pK7GWIWG2D.Таким образом нами былы получены две конструкции (KNOX3i_2+pK7GWIWG2D и KNOX3i_8+ pK7GWIWG2D) для подавления экспрессии генаMtKNOX3.Вдальнейшемэтиконструкциибылыиспользованыдлятрансформации Medicago truncatula с помощью A. rhizogenes (MSU440).С помощью количественной ПЦР в реальном времени мы измерили уровеньэкспрессии MtKNOX3 в трансгенных корнях растении на 12 дпи (Рисунок 35).94Рисунок 35 - Подтверждение снижения уровня экспрессии гена MtKNOX3 вклубеньках на стадии 12 дпи люцерны с помощью количественной ПЦР вреальном времени (в качестве примера приведены результаты ПЦР в реальномвремени для отдельных растений).В клубеньках на трансгенных корнях с первой конструкцией (KNOX3i_2+pK7GWIWG2D), экспрессия MtKNOX3 уменьшается в 4-5 раз по сравнению сконтролем(GUS-OE)трансформированных(Рисуноквторой35),конструкциейавклубеньках(KNOX3i_8+растений,pK7GWIWG2D)изменение уровня экспрессии MtKNOX3 не наблюдали.
Эти результаты,возможно, можно объяснить более эффективной работой первой конструкций.Также наблюдали уменьшение экспрессии MtKNOX3 в трансгенных корнях cРНК-интерференцией MtKNOX3 (приложение 6). В дальнейшем, для оценкивлияния подавления гена MtKNOX3 на клубенькообразование и для анализаэкспрессии генов на фоне подавления экспрессии MtKNOX3 были использованырастения, трансформированные только первой конструкциейpK7GWIWG2D).95(KNOX3i_2+3.3.2.2.
Оценка влияния подавления гена MtKNOX3 на клубенькообразованиеи экспрессию генов, вовлеченных в метаболизм цитокининаНа следующем этапе мы оценили влияние подавления экспрессии генаMtKNOX3 на процесс развития клубеньков и корней. На основании полученныхнами данных подавление экспрессии MtKNOX3 значительно не влияет наколичество и плотность образующихся клубеньков (Рисунок 36).Рисунок 36 - Влияние подавления MtKNOX3 на количество клубеньков (А), длинукорня (Б), плотность клубеньков (В).Перекрывающиеся паттерны экспрессии генов KNOX в развивающихсяклубеньках указывают на то, что функции этих генов, также как и их ортологов уарабидопсиса, могут перекрываться (Di Giacomo, et al., 2016, Furumizu, et al.,2015).
Это может объяснить отсутствие изменений в клубенькообразовании у96растений с подавлением MtKNOX3 (KNOX3-RNAi) в наших экспериментах. Этирезультаты согласуются с данными, полученными в статье Giacomo et al., 2016.Авторы показали, что подавление экспрессии MtKNOX3 методом RNAi невызывает изменения в образования клубеньков, тогда как одновременноеподавление экспрессии MtKNOX3/5/9/10 приводило к формированию «слитых»клубеньков.На следующем этапе мы проанализировали влияние подавления экспрессиигена MtKNOX3 на предполагаемые его мишени, то есть на гены MtIPT и MtLOG,увеличение экспрессии которых мы наблюдали при развитии клубеньков а такжена ген цитокининого ответа (RR4).
В частности, в случае MtIPT3, MtIPT5, MtLOG2и MtRR4 наблюдается статистически значимое уменьшение экспрессии втрансгенных клубеньках с подавлением MtKNOX3 (Рисунок 37). Уменьшениеэкспрессии MtLOG2, MtRR4 и MtLOG1 также наблюдалось в трансгенных корняхс подавлением MtKNOX3 (приложение 6). Экспрессия других генов на фоне РНКинтерференции существенно не меняется (Рисунок 37). Согласно нашим даннымпо временной динамики экспрессии генов максимум экспрессии MtLOG1совпадает с максимумом экспрессии MtKNOX3 и экспрессия MtLOG2 продолжаетвозрастать на поздних сроках развития клубенька (22 дпи). Максимум экспрессииMtIPT3 и MtIPT5, представленный на рисунке 20, тоже совпадает с максимумомэкспрессии MtKNOX3 на той же кДНК (9 дпи).
При этом максимум экспрессииMtIPT1 наблюдается раньше максимума экспрессии гена MtKNOX3 (приложение5).Полученныерезультатыуказываютнато,чтоMtKNOX3можетконтролировать образование активных форм цитокининов при развитииклубенька.97Рисунок 37 - Снижение уровней экспрессии генов MtIPT3, MtIPT5, MtLOG2 иMtRR4 на фоне подавления экспрессии MtKNOX3 путём интерференции – РНК вклубеньках на трансгенных корнях (*, **, *** соответствует P value < 0.05, < 0.01и < 0.001, соответственно).Таким образом, уменьшение экспрессии генов MtIPT3/5, MtLOG2 и MtRR4 нафоне РНК-интерференции MtKNOX3, а также увеличение экспрессии этих генов вклубенькоподобных структурах (спонтанные клубеньки), вместе с совпадениеммаксимума экспрессии этих генов с максимумом экспрессии MtKNOX3,свидетельствует в пользу нашей гипотезы о возможном участии MtKNOX3 вактивацииэкспрессиигеновметаболизма цитокининавходеразвитиясимбиотического клубенька.
Однако, для доказательства участия ТФ MtKNOX3 вактивации экспрессии генов метаболизма цитокинина требуется проведениедополнительных экспериментов, таких как изучение связывания ТФ MtKNOX3 спромоторами предполагаемых генов мишеней и измерение уровня свободныхцитокининов в трансгенных корнях с изменённым уровнем экспрессии MtKNOX3.983.4. Изучение непосредственного связывания ТФ MtKNOX3 с промоторамипредполагаемых генов-мишеней (MtIPT, MtLOG)3.4.1.
Поиск предполагаемых сайтов мишени в промоторах или интронахгенов MtIPT и MtLOGИзвестно, что белки семейства KNOX связываются с конкретнымипоследовательностями в ДНК генов мишеней с помощью третьей спирали ихгомеодомена, но их сайты распознавания, как и у животных, вырождены, и имеюточень короткий консенсус TGAC (Krusell, et al., 1997, Smith, et al., 2002, Tioni, etal., 2005, Viola and Gonzalez, 2006). Кроме того, при изучении ДНК-связывающихмотивов ТФ KN1 или его гомолога HOODED у ячменя с использованием анализасвязывания in vitro, многие клоны ДНК-содержали два мотива TGAC, или одинмотив TGAC и один из неполных мотивов TGA или GAC, разделенные от 0 до 10остатками нуклеотидов (Krusell, et al., 1997, Smith, et al., 2002).
У кукурузы KN1связывается с интроном гена ga2ox1 (который кодирует фермент, участвующий винактивации биологически активных форм гиббереллин) через цис-регуляторныйэлемент, содержащий два мотива TGAC (Bolduc and Hake, 2009). Было показано,что гомеодомен KN1 связывается с гораздо более высоким сродством споследовательностями ДНК, содержащими не один, а два мотива TGAC, как invivo, так и in vitro. Присутствие тандемного повтора TGAC также, было выявленоу картофеля при изучении связывания белка BEL5 (из семейство BEL) и белкаPOTH1 (из семейство KNOX) с промотором гена ga20ox1 картофеля (Chen, et al.,2004).
Эти наблюдения показывают, что истинные гены-мишени KNOX,вероятно, будут иметь цис-регуляторные элементы, содержащие более одногомотива TGAC.На основании этого, мы провели поиск этого мотива в промоторах и интронахпредполагаемыхгенов-мишенейинашлипоследовательности-кандидаты,содержащие два мотива TGAC рядом (LOG1, LOG2-1, IPT3-1 и IPT5). Также быливыбраны две последовательности с одним полным мотивом и несовершенным99мотивом (LOG2-2 и IPT3-2) Кроме того, была найдена одна последовательность впромоторе гена IPT3, но в противоположном направлении (IPT3-3).LOG1:5’-AAACTAACTTTATGATGTGACATGACATCTTTATTATTCT-biotin- 3’LOG2-1: 5’-ATACGGACATGACAAGGACACTGACATGCTGACACAACTA-biotin- 3’IPT3-1:5’-ATTAATTTTTTTAATGACCATTGACTGAATTTAGCACAAT-biotin- 3’IPT5:5’- TTATGTTTCTTATGACCTTTCTGTTGACAGGCCTGCAATG-biotin- 3’LOG2-2: 5’-GTTAAACTTTATGATATGACATGTTGAATATTCTAATTCC-biotin- 3’IPT3-2:5’-TATTTAATTCTTGACGATTATGATTTGATAACTCAAATAT-biotin- 3’IPT3-3:5’- AATAGTTATAAATGTGACAATATTGACTTCCATAATCTCT-biotin- 3’Интересно отметить, что наличие двух или более (полных) мотвов TGACрядом, было обнаружено только в промоторе или интроне генов MtLOG(LOG1/2/3) и MtIPT3/5, экспрессия которых уменьшалась на фоне интерференцииРНК (KNOX3-RNAi), но не в других генах MtIPT, экспрессия которых такжеувеличивается при развитии клубеньков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
