Диссертация (1145941), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Таким образом, цитокинин в зависимости отместа его действия может оказывать как положительное, так и отрицательноевлияние на образование клубеньков. Кроме того, было показано участиецитокининававторегуляцииклубенькообразования(AON).Продукцияцитокинина активируется в побеге после CLV1-подобной киназы (HAR1) –ключевого компонента AON (Sasaki, et al., 2014). Однако, факторы, ответственныеза активацию биосинтеза цитокинина в ходе развития клубенька, остаются неизвестными. Мы предположили, что по аналогии с меристемой побега, активациябиосинтеза цитокинина может происходить за счёт действия транскрипционныхфакторов семейства KNOX. Настоящая работа посвящена изучению роли геновKNOX в развитии клубенька у люцерны и их возможного участия в активациибиосинтеза цитокинина.Одним из модельных бобовых растений для изучения развития клубеньковявляется люцерна слабоусеченная (Medicago truncatula Gaertn).
Удобство этогообъекта связано с тем, что у M. truncatula относительно короткий жизненный55цикл (около 3 месяцев), и это растение легко культивировать в лабораторныхусловиях. Кроме того, геном M. truncatula секвенирован, что облегчаетпроведение молекулярно-генетических экспериментов с этим объектом, которыйшироко используется в исследованиях микробно-растительных взаимодействий.В связи с этим, люцерна Medicago truncatula была выбрана объектом настоящегоисследования.56Глава 2. Материалы и методы2.1. Растительный материалВ работе использовали линию люцерны диплоидной Medicago truncatulaGaertn A17, полученных из сорта Jemalong (получены из Университета г.Вагенингена, Нидерланды) и мутантную линию люцерны диплоидной sunn-3,которые были предоставлены коллегами из Университета г.
Гента (VIB, UGent,Бельгия).2.2. Условия выращивания растенийСтерилизацию семян проводили с использованием концентрированной сернойкислоты (95-97%) в течение 10 минут, после чего семена промывали стерильнойводой 7-10 раз. Семена высевали на 1% водный агар и оставляли в холодильникена +4 на 24 часа, затем проращивали в темноте в течение 48 часов. Выращиваниерастений осуществляли в фитотроне (KBW F240, Binder, Германия) с режимомдень/ночь 16/8 часов, 21oC при освещенности 30 тыс.
люкс. Образцы корней, атакже листья для выделения РНК собирали на разные дни после инокуляции (дпи)ризобиями (Sinorhizobium meliloti 2011) (с 1 дпи до 21 дпи в зависимости отэксперимента), брали корни 3-4 растения на пробу.2.3. Штаммы микроорганизмовДля инокуляции растений люцерны Medicago truncatula использовали штаммSinorhizobium meliloti 2011, полученный из лаборатории генетики растенийуниверситета г. Вагенингена, Голландия. Для клонирования генетическихконструкций использовали штамм Escherichia coli DH5α.
Для трансформациирастений использовали штаммы Agrobacterium rhizogenes MSU440 и Arqua.572.4. Векторы и генетические конструкцииКодирующую и промоторную области изучаемого гена клонировали в векторpDONR221 (Invitrogen, США) с помощью BP-клоназы (Invitrogen, США). Напоследующем этапе кодирующую область переклонировали в вектор pB7WG2D(VIB-UGENT, Бельгия), а промоторную область переклонировали в векторpBGWFS7,0 (VIB-UGENT, Бельгия) с помощью LR-клоназы (Invitrogen, США).Для подавления экспрессии гена MtKNOX3, фрагменты длиной 105 и 150 п.о.были клонированы в вектор pENTR-D-TOPO и затем переклонированы спомощью LR-клоназной системы в вектор pK7GWIWG2D (VIB-UGent, Бельгия).2.5.
Среды и условия культивирования бактерийДля выращивания бактерий Escherichia coli на твёрдых или жидких средахиспользовали среду LB (NaCl –10 г, триптон –10 г, дрожжевой экстракт –5 г, агар–15 г на один литр среды). Культуры E. coli выращивали в термостате при 37оС.Трансформантов отбирали на среде LB с антибиотиками.Для выращивания бактерий ризобий использовали среду YEM (H2PO4 – 0.5 г,MgSO4x7H2O - 0,2 г, NaCl - 0,1 г, маннитол - 10 г, дрожжевой экстракт - 1 г наодин литр среды).
Растения люцерны M. truncatula инокулировали штаммомSinorhizobium meliloti 2011. Жидкие культуры выращивали в среде YEM при 28oCдо оптической плотности A600=0,7-1. Растения инокулировали с использованием 1мл бактериальной суспензии на растение.2.6. Выделение растительной ДНКВыделениекоммерческогосуммарнойнабораДНКDNeasyрастений(Qiagen,производителя.58проводилиГермания)сиспользованиемсогласнопротоколу2.7. Получение компетентных клеток E. coliХимически компетентные клетки E. coli DH5α получали с мощью методаInoue и соавторов (Inoue, et al., 1990).2.8. Выделение плазмидной ДНКПлазмидную ДНК выделяли из ночной культуры клеток E.coli с помощьюнабора для выделения плазмидной ДНК (Евроген, Россия).2.9. Секвенирование ДНКАнализ последовательностей ДНК по методу, описанному Sanger ссоавторами (секвенирование) (Sanger and Coulson, 1975) проводили с помощьюавтоматического секвенатора ABI Prism 310 (Ресурсный центр СПбГУ) попротоколу производителя.2.10.
Выделение тотальной РНК растенийОбразцы корней для выделения РНК собирали на разные дни послеинокуляции. РНК выделяли с использованием RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen,Германия, Cat No./ID: 74904) согласно протоколу производителя. ОбработкуДНКазы проводили с использованием набора для удаления ДНК (Rapid Out DNARemoval Kit, Thermo Fisher Scientific, США). Качество образцов контролировали иколичественно определяли с помощью спектрофотометра UV-Vis Nano Drop2000c (Thermo Scientific, США)2.11. Анализ экспрессии генов с помощью метода ОТ-ПЦР (ПЦР,совмещенная с обратной транскрипцией)Синтез кДНК проводили с равным количеством РНК во всех временныхточках в каждом эксперименте (варьируя от 400 нг до 1 мкг РНК в разныхэкспериментах) с использованием обратной транскриптазы Revert Aid (ThermoFisher Scientific, США).
Реакционную смесь инкубировали в течение 1 часа при5942°C с последующим прогреванием в течение 10 минут при 70 °C. Полученныепробы кДНК разводили до конечного объема 100 мкл. В состав реакционнойсмеси для ПЦР общим объемом 20 мкл входило 2 мкл полученного растворакДНК в 10 мМ трис-HCl (pH 8,3), 50 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl2, 10 мМ дНТФ, 10 пМкаждого праймера, 1 ед. Taq-полимеразы.
Амплификацию проводили последующей программе: 30 сек при 94 oC, затем 30 сек при 56 oC и 40 сек при 72oC, 28 циклов, 5 мин при 72 oC с праймерами к анализируемым генам (см.Приложение 15).ПЦР продукты разделяли в 1% агарозном геле. Качество и количества РНКконтролировали с помощью реакции с праймерами к гену убиквитину.2.12.
Количественный анализ экспрессии генов с помощью ОТ-ПЦР сдетекцией в реальном времениПЦР с детекцией в реальном времени проводили с помощью амплификатораCFX96(Bio-RadLaboratories,США).Детекциябыладостигнутасиспользованием интеркалирующего красителя Eva (Синтол, Россия). Реакциюпроводили в общем объеме 20 мкл. Амплификацию проводили по программе:95oC,30 сек, 56oC, 30 сек и 72oC, 40 сек, 45 циклов. Флуоресценцию красителя EvaGreen регистрировали при 72oC в конце каждого цикла. Относительные уровниэкспрессии анализируемых генов определяли по методу Livak (Livak andSchmittgen, 2001). Данные по количественной оценке анализируемого генарассчитали по сравнению с экспрессии референсных генов убиквитина и актина ипредставлены в относительных единицах. В качестве пробы-калибратораиспользовали контроль без инокуляции, которые были взяты одновременно синокулированными растениями (NI-3, 5, 7, 10 дней).
Экспрессия генов в разныхсроках после инокуляции проанализировали в трех независимых биологическихповторностях.602.13. Получение компетентных клеток A. rhizogenesДля получения электрокомпетентных клеток A. rhizogenes 10 мл среды LB безNaCl инокулировали единичными колониями и выращивали в течение ночи при28 oC. После этого 9 мл ночной культуры добавляли к 900 мл среды LB без NaCl ивыращивали до оптической плотности 0,4-0,5 при 28 oC.
Затем суспензию клетокпереносили в центрифужные стаканы и цетрифугировали в течение 20 минут при+4 oC при 3500 об/мин (Beckmann Avanti J25, США). Затем клетки промывали 4раза стерильной деионизированной водой и 8,7 % глицерином. После этогоклетки ресуспендировали в 5 мл 8,7 % глицерина, и готовили аливоты по 25-50мкл, храненили при-70 oC.2.14. Трансформация растений с помощью A. rhizogenesРастения люцерны трансформировали с помощью штаммом Agrobacteriumrhizogenes, несущим генетическую конструкцию 35S:MtKNOX3, pMtKNOX3:GUSили MtKNOX3-RNAi. Трансформацию осуществляли по протоколу, описанномуLimpens и соавторами (Limpens, et al., 2004), таким образом, что проросткирастения срезали в области гипокотиля и нанесли суспензию бактерий на срез.Проростки культивировали с агробактериями в течение 5 дней на твердойпитательной среде Farhaeus.
Затем экспланты переносили на среду с добавлениемцефотаксима 300 мкг/мл и культивировали до регенерации корней, после чегорастения пересаживали в горшочки, заполненные субстратом вермикулитом cдобавлением жидкой среды Farhaeus. Инокуляцию люцерны диплоиднойпроводили с использованием штамма ризобий Sinorhizobium meliloti 2011. Отбортрансгенных корней (в случае использования конструкций 35S: MtKNOX3 иMtKNOX3-RNAi) проводили с помощью флуоресцентного стереомикроскопа LeicaM205FA в ресурсном центре «Развитие молекулярных и клеточных технологий»СПбГУ.612.15.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
