Диссертация (1145941)
Текст из файла
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждениевысшего образования«САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»На правах рукописиАзарахш МахбубехИзучение роли транскрипционного фактора KNOX3 в процессеорганогенеза клубеньков бобовых растенийСпециальность: 03.02.07 ГенетикаДиссертацияна соискание учёной степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:доктор биологических наук, профессорЛутова Людмила АлексеевнаСанкт-Петербург2018СодержаниеВведение………………………………………………………………………...……...8Глава 1.
Обзор литературы1.1. Транскрипционные факторы семейства KNOX и их роль в развитиирастений………………………………………………………………………………..131.1.1. Гены KNOX первого класса (KNOX I)……………………………...…………151.1.2. Гены KNOX второго класса (KNOX II)……………………………...………...171.1.3. Взаимодействие белков KNOX-BELL…………………………………….......191.1.4. Гены KNOX у растений из семейства бобовые……………………………….201.2. Цитокинины и их роль в развитии растений…………………………………...221.2.1.
Биосинтез, катаболизм и инактивация цитокининов………………………...231.3. Роль транскрипционных факторов и гормонов в регуляции активностимеристемы побега……………………………………………………………………..271.3.1. Участие генов KNOX в регуляции биосинтеза цитокинина………….…...…291.4. Регуляция развития симбиотических клубеньков……………………………...321.4.1. Молекулярные основы бобово-ризобиальных взаимодействий………….…331.4.1.1. Инфицирование ризобиями тканей корня растения……………………….351.4.1.2.
Восприятие Nod-фактора…………………………………………………….361.4.1.3. Сигнальный каскад, активируемый Nod-фактором………………………..371.4.2. Системный контроль клубенькообразования (авторегуляция, AON)………401.4.3.Рольцитокининавразвитииклубеньков(регуляторныепути,фунционируюшие в коре корня)……………………………………………………..461.4.3.1. Идентификация ключевых компонентов клубенькообразования, связанныхс цитокинином (сигнальный путь, индуцируемый цитокинином)………………...461.4.3.2.
Роль цитокинина в развитии инфекционных нитей и инициациипримордиев клубеньков………….…………………………………………………...501.4.3.3. Цитокинин и авторегуляция клубеньткообразования……………………..511.4.4. Роль ауксина в развитии клубеньков………………………………………….5221.5. Заключение………………………………………………………………………..54Глава 2. Материалы и методы2.1. Растительный материал…………………………………………………………..572.2. Условия выращивания растений……………………………………………...…572.3. Штаммы микроорганизмов………………………………………………………572.4. Векторы и генетические конструкции………………………………………..…582.5. Среды и условия культивирования бактерий…………………………………..582.6.
Выделение растительной ДНК………………………………………………..…582.7. Получение компетентных клеток E. coli………………………………………..592.8. Выделение плазмидной ДНК……………………………………………………592.9. Секвенирование ДНК………………………………………………………..…...592.10. Выделение тотальной РНК растений……….………...………………………..592.11. Анализ экспрессии генов с помощью метода ОТ-ПЦР (ПЦР, совмещенная собратной транскрипцией)…………………………………………………………….592.12. Количественный анализ экспрессии генов с помощью ОТ-ПЦР с детекцией вреальном времени……………………………………………………………………..602.13. Получение компетентных клеток A. rhizogenes……………………………….612.14. Трансформация растений с помощью A. rhizogenes………………………….612.15.
Анализ активности репортерного белка бета-глюкоронидазы в трансгенныхтканях растений……………………………………………………………………….622.16. Получение срезов тканей растений……………………………………………622.17. Создание конструкции для гетерологичной экспрессии KNOX3-CDS иKNOX3-HD в Pichia pastoris, культивирование штаммов-продуцентов, выделениеи очистка белка……………………………………………………………...……...…622.18.анализсдвигаэлектрофоретическойподвижности(англ.EMSA:Electrophoretic Mobility Shift Assay)……………………………………………….....632.19.Анализвзаимодействияспомощьютехнологииповерхностногоплазмонного резонанса (англ. SPR: surface plasmon resonance)…...…………….....6432.20. Обработка растений нитратом………………………………………………....652.21. Компьютерные программы и статистические методы , используемые вработе ……………………………………………………...…………………………..65Глава 3. Результаты и обсуждение3.1.
Анализ экспрессии генов семейства KNOX при клубенькообразовании……..673.1.1. Количественный анализ экспрессии генов MtKNOX на разных стадияхразвитии клубеньков………….……………………………………………………….673.1.1.1. Анализ последовательностей генов MtKNOX в базах данных, подборпраймеров……………………………………………………………………………...673.1.1.2. Анализ экспрессии генов MtKNOX на разных стадиях развитии клубеньковс помощью количественной ПЦР в реальном времени…………………………….683.1.2. Локальный анализ экспрессии гена MtKNOX3 при клубенькообразовании..703.1.2.1.созданиевекторадлялокализацииэкспрессиигенаMtKNOX3(pMtKNOX3:GUS)……………………………………………………………………..703.1.2.2.
Трансформация полученным вектором растений М. truncatula с помощьюA. rhizogenes и анализ активности промоторов гена MtKNOX3 с помощьюрепортерного белка GUS…………………………...………………….......................723.2. Анализ экспрессии генов MtIPT и MtLOG, вовлеченных в метаболизмцитокинина, при клубенькообразовании……………………………………..……...743.2.1. Поиск последовательностей генов, кодирующих IPT M. truncatula, в базахданных, подбор праймеров…………………………………………………………...753.2.2. Анализ экспрессии генов MtIPT на разных стадиях развития клубеньков спомощью количественной ПЦР в реальном времени………………………………773.2.3.
Поиск последовательностей генов, кодирующих LOG M. truncatula, в базахданных, подбор праймеров…………………………………………………………...783.2.4. Анализ экспрессии генов MtLOG на разных стадиях развитии клубеньков спомощью количественной ПЦР в реальном времени………………………………7943.3. Изучение роли гена MtKNOX3 с помощью изменения уровня экспрессии этогогена в трансгенных корнях……………………………………………………………813.3.1.ИзучениевлияниясверхэкспрессиигенанаMtKNOX3развитиеклубеньков……………………………………………………………………………..813.3.1.1.Созданиевекторов,трансформациярастенийполученнымиконструкциями с помощью A.
rhizogenes…………………………………………....813.3.1.2.ОценкавлияниясверхэкспрессиигенаMtKNOX3наклубенькообразование………………………………………………………………..863.3.1.3. Оценка уровня экспрессии симбиоз-индуциркемых генов MtIPT и MtLOGв спонтанных клубеньках (клубенькоподобных структурах)…..………...………..903.3.2. Изучение влияния искусственного подавления экспрессии гена MtKNOX3 спомощьюинтерференцииРНКнаразвитиеклубеньковиэкспрессиюпредполагаемых генов-мишеней (MtIPT, MtLOG)…………………………..……...913.3.2.1.Созданиевекторов,трансформациярастенийполученнымиконструкциями с помощью A. rhizogenes……………………………………………923.3.2.2.
Оценка влияния подавления гена MtKNOX3 на клубенькообразование иэкспрессию генов, вовлеченных в метаболизм цитокинина……………………….963.4. Изучение непосредственного связывания ТФ MtKNOX3 с промоторамипредполагаемых генов-мишеней (MtIPT, MtLOG)………………………………….993.4.1. Поиск предполагаемых сайтов мишени в промоторе или интроне геновMtIPT и MtLOG……….……………………………………………………………….993.4.2. Наработка гомеодомена ТФ MtKNOX3 в гетерологичной системе дляпоследующего анализа его связывания с последовательностями-мишенями(Создание конструкции, трансформация дрожжей P. Pastoris, наработка и очисткабелка)…………………………………………………………………………………1013.4.3.
Изучение связывания гомеодомена ТФ MtKNOX3 с предполагаемымисайтами-мишенями…………………………………………………………………..10553.4.3.1. Изучение связывания гомеодомена MtKNOX3 с последовательностямимишениями с помощью анализа сдвига электрофоретической подвижностиElectrophoretic mobility shift assay, EMSA)…………………………………………1053.4.3.2. Изучение связывания гомеодомена MtKNOX3 с последовательностямимишениями с помощью метода на основе ППР (поверхностный плазмонныйрезонанс, анг. SPR) с использованием системы ProteON…………………...…….1063.5. Исследование взаимосвязи ТФ MtKNOX3 с компонентами системыавторегуляции клубенькообразования (AON): CLV1-подобной киназой MtSUNN иCLE-пептидами…………………………………………………………………...….1083.5.1.ИзучениеэкспрессиигеновMtKNOXиMtIPTусуперклубенькообразующего мутанта sunn-3 (в.т.ч локальный анализ экспрессииMtKNOX3)…………………………………………………………………………….1083.5.1.1.
Анализ экспрессии генов MtIPT в побеге в ответ на инокуляции урастений дикого типа и суперклубенькообразующего мутанта sunn-3……..…...1093.5.1.2. Анализ экспрессии генов MtKNOX в побеге в ответ на инокуляции урастений дикого типа и суперклубенькообразующего мутанта sunn-3………….1113.5.1.3.АнализэкспрессиигеновMtIPTиMtKNOXвкорняхсуперклубенькообразующего мутанта sunn-3……………………………………..1133.5.1.4.ЛокальныйанализэкспрессиигенаMtKNOX3усуперклубенькообразующего мутанта sunn-3………………………………..……1153.5.2. Изучение влияния подавления экспрессии гена MtKNOX3 с помощьюинтерференцииРНКнаэкспрессиюгеновCLE,активируемыхприклубенькообразовании………………………………………………………………1173.5.2.1. Анализ экспрессии клубенек-специфичных генов CLE (в т.ч.
изучениевлияния нитрата на экспрессию генов CLE)……………………………………….1173.5.2.2. Изучение влияния подавления экспрессии гена MtKNOX3 на экспрессиюCLE……………………………………………………………………………………121Глава 4. Заключение……………………………………………………………….1236Выводы………………………………………………………………………………128Список сокращений………………………………………………………………..129Список литературы………………………………………………………………...130Благодарности………………………………………………………………………158Приложение…………………………………………………………………………1597ВведениеАктуальность проблемы. Рост и развитие растений в постэмбриональныйпериод обусловлены наличием меристем, активность которых позволяетрастениям образовывать новые ткани и структуры на протяжении всей их жизни.Благодаря этому, растения, ведущие прикрепленный образ жизни, способныадаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды.
Растительныеклеткихарактеризуютсядифференцированныеклеткивысокоймогутстепеньютотипотентности:дедифференцироватьсяиповторнодифференцироваться в другие типы клеток в ходе онтогенеза, что можетсопровождаться формированием меристем de novo. Одним из примеровформирования новых органов и закладки меристем de novo у растений являетсяразвитие азотфиксирующих клубеньков у бобовых растений при симбиозе спочвенными бактериями ризобиями.Формирование симбиотического клубенька у бобовых растений представляетсобоймодельнуюсистемудляизученияпроцессовпролиферацииидедифференциации клеток.
Кроме того, симбиотические клубеньки представляютсобой «фабрики», в которых происходит уникальный процесс – биологическаяфиксация молекулярного азота. При этом сами по себе растения и животные неспособны к биологической азотфиксации, и этот процесс происходит в природе сучастиемрядамикроорганизмовисине-зеленыхводорослей.Благодаряфункционированию симбиотических клубеньков, в тканях бобовых растенийнакапливаютсяазотсодержащиеорганическиесоединения,белки,обуславливающие высокую питательную ценность этих культур.
Поэтомубобовые растения имеют большое практическое значение для сельского хозяйстваи применяются в севообороте для обогащения почвы азотом, что позволяетснизить количество вносимых азотсодержащих удобрений. В связи с этим,изучение механизмов развития клубеньков бобовых растений представляетсяважным и актуальным и имеет как фундаментальное, так и практическоезначение.8Регуляция баланса пролиферирующих клеток в меристемах при развитиирастений осуществляется с участием транскрипционных факторов (ТФ) игормонов.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
