Диссертация (1145941), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Изучение взаимосвязи ТФ и гормонов как основных регуляторовразвития растений является важной задачей биологии развития.Степень разработанности темы. К числу важнейших групп ТФ относятгомеодомен-содержащие ТФ, в частности, транскрипционные факторы семействаKNOX. ТФ KNOX относятcя к суперсемейству белков TALE с гомеодоменом.Впервые ТФ, содержащие гомеодомен, были описаны у животных как ключевыерегуляторы развития. У растений ТФ KNOX известны как основные регуляторыфункционирования побеговой апикальной меристемы (ПАМ). Показано, чтомишенями транскрипционных факторов (ТФ) KNOX в меристеме побегаявляютсягены,кодирующиеизопентинилтрансферазы(IPT),ферментыбиосинтеза цитокинина, гормона, играющего ключевую роль в поддержанииактивности апикальной меристемы побега.
Цитокинин также играет важную рольв развитии азотфиксирующих клубеньков, формирующихся на корнях бобовыхрастений. Известно, что компоненты цитокининного сигналинга активируются вответ на Nod-фактор у бобовых растений. Более того, недавно было показано, чтоцитокинин также вовлечён в систему авторегуляции клубенькообразования (англ.autoregulation of nodulation, AON): синтезируемый в побеге цитокинин поступаетв корень и подавляет образование клубеньков. У ряда бобовых растений в ходеразвития клубеньков была выявлена активация экспрессии генов IPT, а такжегеновLOG(LONELYGUY),кодирующихферменты,необходимые дляобразования активных форм цитокинина.
Однако, возможные активаторыбиосинтеза цитокинина в клубеньках не известны. Поскольку известно, что вмеристеме побега ТФ KNOX активируют экспрессию генов биосинтезацитокинина IPT, представляет интерес изучение роли генов KNOX в развитиисимбиотического клубенька и исследование возможной роли генов KNOX вактивации биосинтеза цитокинина при клубенькообразовании.9Целью нашей работы является изучение роли генов KNOX в развитии клубенька улюцерны слабоусеченной (Medicago truncatula) и их возможной роли в активациибиосинтеза цитокинина.Задачи работы включают:1. Анализ экспрессии генов семейства MtKNOX при клубенькообразовании1.1. Количественный анализ экспрессии генов MtKNOX на разных стадияхразвития клубеньков1.2. Локальный анализ экспрессии гена MtKNOX3 при клубенькообразовании2.
Анализ экспрессии генов MtIPT и MtLOG, вовлеченных в метаболизмцитокинина, при клубенькообразовании3. Изучение роли гена MtKNOX3 с помощью изменения уровня экспрессииэтого гена в трансгенных корнях.3.1. Изучение влияния сверхэкспрессии гена MtKNOX3 на развитиеклубеньков.3.2. Изучение влияния искусственного подавления экспрессии гена MtKNOX3с помощью интерференции РНК на развитие клубеньков и экспрессиюпредполагаемых генов - мишеней (MtIPT, MtLOG)4.
Изучение непосредственного связывания ТФ MtKNOX3 с промоторамипредполагаемых генов-мишеней (MtIPT, MtLOG)5. Исследование взаимосвязи ТФ MtKNOX с компонентами системыавторегуляции клубенькообразования (AON): CLV1-подобной киназой MtSUNN иCLE-пептидами5.1.ИзучениеэкспрессиигеновMtKNOXиMtIPTусуперклубенькообразующего мутанта sunn-3 (в.т. ч. локальный анализ экспрессииMtKNOX3)5.2. Изучение влияния подавления экспрессии гена MtKNOX3 с помощьюинтерференцииРНКнаэкспрессиюклубенькообразовании10геновCLE,активируемыхприНаучная новизна диссертационной работы.
Впервые показано участиетранскрипционных факторов KNOX в развитии симбиотических клубеньков улюцерны (M. truncatula). Впервые показана активация экспрессии ряда геновсемейства IPT в развивающихся клубеньках. Впервые показана взаимосвязьмежду ТФ KNOX3 и активацией цитокининового ответа при развитииклубеньков.
Впервые показана активация экспрессии генов KNOX в побеге в ответна инокуляцию, что указывает на возможное участие этих генов в AON. Такжепоказано возможное участие ТФ KNOX3 в авторегуляции клубенькообразованиячерез влияние на экспрессию генов, кодирующих CLE-пептиды. На основеполученных данных предполагается общность механизмов активации биосинтезацитокининавПАМ,вклубеньках,атакжеприавторегуляцииклубенькообразования.Методы исследования и достоверность результатов исследования. Вработеиспользованыразнообразныемолекулярно-генетическиеметоды(клонирование фрагментов генов, трансформация бактерий, дрожжей и растений,ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, анализ сдвига электрофоретическойподвижности (EMSA), метод на основе поверхностного плазмонного резонанса(SPR)), биохимические методы, такие как выделение и очистка белка из дрожжей,белковый электрофорез и вестерн-блот, методы микроскопии (визуализацииэкспрессии (GUS-окрашивание), приготовление микропрепаратов и т.д.), методыкультивированиярастенийinvitro,компьютерныйанализданныхистатистические методы для оценки достоверности результатов.
Исследованиепроводили с использованием в качестве модельного объекта Medicago truncatula(Jemalong A17). Достоверность экспериментальных данных, представленных вдиссертации, подтверждена воспроизводимостью результатов в несколькихбиологических и технических повторностях и доказана с применением методовматематической статистики.11Основные положения, выносимые на защиту.1) Транскрипционные факторы MtKNOX, а именно MtKNOX3/5/9, участвуютв регуляции развития клубеньков у люцерны M. truncatula.2)МеханизмдействиятранскрипционногофактораMtKNOX3приклубенькообразовании связан с активацией биосинтеза цитокинина, о чемсвидетельствуетизменениеэкспрессиигеновбиосинтезацитокининавтрансгенных корнях с изменением экспрессии гена MtKNOX3, а также прямоесвязывание гомеодомена MtKNOX3 с регуляторными последовательностямигенов MtIPT и MtLOG.3) Транскрипционные факторы MtKNOX участвуют в авторегуляцииклубенькообразования, и их экспрессия в побеге и корне регулируется с участиемкиназы MtSUNN.Теоретическая и практическая значимость работы.
Предложена новаясхема, объясняющая участие ТФ KNOX в клубенькообразовании у люцерны и ихроли в биосинтезе цитокинина. Результаты работы расширили понимание ролитранскрипционных факторов KNOX в развитии растений и, в частности, приклубенькообразовании. Результаты данной работы могут быть использованы вматериалах курсов лекций «Симбиогенетика», «Генетика развития растений» и«Актуальные проблемы биотехнологии», читаемых на кафедре генетики ибиотехнологии СПбГУ.Апробацияработы.Основныерезультатыдиссертационнойработыпредставлены в виде четырех статей, опубликованных в ведущих журналах, атакже в виде устных и стендовых докладов на научных конференциях.Работа выполнялась при поддержке грантов РНФ: 16-16-10011, РФФИ: 15-34271, РФФИ: 14-04-00591Объём и структура работы.
Диссертация состоит из введения, 4 глав иприложений. Полный объём диссертации составляет 178 страницы с 54рисунками и 2 таблицами. Список литературы содержит 234 наименований.12Глава 1. Обзор литературы1.1. Транскрипционные факторы семейства KNOX и их роль в развитиирастенийГены KNOX кодируют транскрипционные факторы (ТФ), которые относятся ксуперсемейству гомеодоменсодержащих белков TALE (Three Amino acid LoopExtension).
Его характерной чертой является наличие трёх дополнительныхаминокислотмеждупервойивторойальфа-спиралямигомеодомена.Представители группы ТФ TALE встречаются как у животных, так и у растений(Hamant and Pautot, 2010).Гомеодомен ТФ KNOX расположен на С-концевой части белка. Этот доменнеобходим для связывания транскрипционного фактора с регуляторнымипоследовательностями ДНК (и следовательно, контролирует специфичностьсвязывания), а также, возможно, участвует в образовании гомодимеров. Рядом сгомеодоменом (ближе к N-концу) расположен так называемый ELK домен(обогащенный аминокислотами Glu (E), Leu (L), Lys(K)).
Функция домена ELK неясна, но предполагается, что он содержит сигнал ядерной локализации и можетдополнительно участвовать в репрессии транскрипции. Домен GSE (обогащенныйаминокислотами Gly (G), Ser (S), Glu (E)) расположенный ближе к N-концуотносительно домена ELK, участвует в регуляции стабильности белка, посколькувегосоставеприсутствуетпоследовательностьPEST(обогащеннаяаминокислотными остатками Pro (P), Glu (E), Ser (S), Thr (T), которая, каксчитается, задействована в деградации белка через убиквитин-зависимый путь.Домен MEINOX, состоящий из поддоменов KNOX1 и KNOX2, находится в Nконцевой части белка и необходим для белок-белковых взаимодействий (Scofieldand Murray, 2006) (Рисунок 1).13Рисунок 1 - Схема доменной организации белка KNOX (Scofield, Murray, 2006).Ген KNOTTED1 кукурузы (KN1) был выделен два десятилетия назад прианализе мутантов, полученных методом транспозонного мутагенеза.
У мутантовпо гену KN1 наблюдалось образование «узелков» на листьях (‘knotted’ leaves), чтои обусловило название таких мутантов. Было показано, что ген KN1 принадлежитсемейству транскрипционных факторов (ТФ) с гомеодоменом (Vollbrecht, et al.,1991). Это открытие вызвало значительное волнение среди специалистов вобласти генетики развития, поскольку несколько лет до этого выделениегомеобокс-содержашихгеновуживотныхизменилопредставлениеомолекулярных основах развития и эволюции многоклеточных организмов.Клонирование первого представителя семейства генов KNOX у кукурузы,KNOTTED 1 (KN1), привело к подобному взрыву в области генетики развитиярастений (Hake, et al., 1995).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
