Диссертация (1145941), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Эти результатыбыли подтверждены и в другой биологической повторности.Полученные результаты согласуются с данными по крупномасштабномуисследованию экспрессии генов M. truncatula, доступными в базе данныхGENEEXPRESSION ATLAS (http://mtgea.noble.org/v3/), согласно которым вобразцах, полученных из инокулированных ризобиями корней, происходитактивация экспрессии гена MtKNOX3 (AB033479.1).
Это указывает на возможноеучастие гена MtKNOX3 в развитии симбиотического клубенька.Таким образом для дальнейшей работы, из проанализированных геновMtKNOX M. truncatula был выбран ген - MtKNOX3, экспрессия которогоувеличивается в значительно большей степени, чем экспрессия других геновMtKNOX. Для более детального исследования роли этого гена необходимлокальный анализ его экспрессии при развитии симбиотических клубеньков. Дляэтой цели нами была создана конструкция, содержащая промотор гена MtKNOX3,соединенный с репортерным геном GUS.693.1.2.ЛокальныйанализэкспрессиигенаMtKNOX3приклубенькообразовании3.1.2.1.
создание вектора для локализации экспрессии гена MtKNOX3(pMtKNOX3:GUS)Для амплификации промотора гена MtKNOX3 на матрице геномной ДНКлюцерны диплоидной были подобраны праймеры, содержашие attB сайт, которыйдаёт возможность клонирования в векторе pDONR221 с помощью BP-клоназнойреакции:pMtKNOX3_FOR 5’-AAAAAAGCAGGCTTC AATGGACTATCAAATGGAGGC -3’pMtKNOX3_REV5’CAAGAAAGCTGGGTTAAAACTTAACAAAAGAAACAAAACA-3’C помощью этих праймеров мы амплифицировали фрагмент размером 2204п.о. до старт-кодона ATG гена MtKNOX3 с использованием Taq-полимеразы(Силекс, Россия) (см. Рисунок 14). Амплификацию проводили по следующейпрограмме: 30 сек при 94 oC, 30 сек при 56 oC и 1.5 мин при 72 oC, 30 циклов.Рисунок 14 - Амплификация промотора MtKNOX3.
MW- Маркер молекулярноговеса. 1,2 – Продукт ПЦР с праймерами к промотору гена MtKNOX3 на матрицеДНК люцерны.Наследующемэтапеcпомощьюсконструированныхпраймеровамплифицировали промотор гена MtKNOX3 с помощью высокоточной LRполимеразы (Силекс, Россия). Полученный фрагмент был клонирован в вектор70pDONR221® (Invitrogen, США) с помощью BP-клоназы (Invitrogen, США), изатем переклонирован с помощью attR-attL рекомбинации c использованиемфермента LR-клоназы (Invitrogen, США) в вектор pBGWFS7.0 (VIB-UGent,Бельгия), содержащий последовательности репортерных генов GFP/GUS итерминатора T35S. Схема вектора приведена на рисунке 15.Правильность клонирования проверяли с помощью рестрикционного анализас использованием рестриктаз PstI и SalI (Рисунок 16).Рисунок 15 - Схема вектора pBGWFS7.0.71Рисунок 16 - А и Б: Размеры ожидаемых фрагментов рестрикции, получаемыхпри обработке вектора pBGWFS7.0 без вставки (А) и со вставкой промоторнойобласти гена MtKNOX3 (Б) с помощью рестриктазы PstI.
В: Рестрикционныйанализ вектора pBGWFS7.0 со вставкой промоторной областей MtKNOX3. MWМаркёр молекулярного вес; 1. pBGWFS7.0 + pKNOX3/PstI; 2. pBGWFS7.0/PstI; 3.pBGWFS7.0 + pKNOX3/SalI; 4. pBGWFS7.0/SalI.Размеры полученных фрагментов рестрикции совпадают с ожидаемыми.Исходя из этого, мы сделали вывод, что фрагменты кодирующих областейклонированы в вектор в правильном положении и в нужной ориентации.Таким образом, нами были получены конструкции для изучения локальногоанализа экспрессии генов MtKNOX3. Этот вектор был введён в штаммыA.rhizogenes.3.1.2.2.
Трансформация полученным вектором растений М. truncatula спомощью A. rhizogenes и анализ активности промоторов гена MtKNOX3 спомощью репортерного белка GUSИспользование A. rhizogenes позволяет получить композитные растения странсгенными корнями. Показано, что по структуре такие трансгенные корни,72образующиеся после трансформации A. rhizogenes, не отличаются от обычныхнетрансформированных корней, и более того, на таких трансгенных корнях послеинокуляциибактериямиризобиямиобразуютсятрансгенныеклубеньки.Использование такого подхода для бобовых растений позволило изучить рольразличных генов в развитии симбиотических клубеньков (Di Giacomo, et al., 2008,Mortier, et al., 2010, Osipova, et al., 2012).Мы трансформировали проростки Medicago truncatula (A17) с помощьюштамма A.rhizogenes, содержащего конструкцию pMtKNOX3:GUS.
Полученные врезультатетрансформациипредположительнотрансгенныекорнибылиподвергнуты GUS-окрашиванию. Его результаты представлены на рисунке 17.Рисунок 17 - Активность промотора MtKNOX3 в клубеньках растений,трансформированныхконструкциейpMtKNOX3:GUS(результатGUS-окрашивания). Масштабная шкала - 100 мкм. Толщина срезов, 50 мкм.На самых ранних этапах развития клубеньков (3-5 дпи) экспрессиюpMtKNOX3::GUS наблюдали в перицикле, эндодерме и во внутренних слояхклетоккоры,гдепроисходятпервыеделенияклетокприразвитиинедетерминированных клубеньков (Рисунок 17А).
На последующих стадиях73развития клубеньков (7-10 дпи) MtKNOX3 экспрессируется в пролиферирующихклетках примордия (Рисунок 17Б), а затем (12-15 дпи) экспрессия наблюдается вапикальной зоне клубенька, где формируется меристема клубенька, а также вместе формирования будущих проводящих тканей (Рисунок 17Б,В). На позднихстадиях (18 дпи) активность промотора MtKNOX3 наблюдали в периферическойзоне клубенька (Рисунок 17Г).Данные анализа активности промотора гена MtKNOX3 на различных этапахразвития клубенька согласуются с данными по динамике экспрессии MtKNOX3,полученными с помощью метода количественной ОТ-ПЦР в реальном времени.Локализация экспрессии MtKNOX3 в клетках примордия и в зоне закладкимеристемы и проводящих тканей клубенька согласуется с высоким уровнемэкспрессии этого гена на 9-12-15 дпи.3.2.
Анализ экспрессии генов MtIPT и MtLOG, вовлеченных в метаболизмцитокинина, при клубенькообразованииИзвестно, что при развитии клубенька происходит активация экспрессиигенов первичного ответа на цитокинин – MtRR9 и MtRR4 (см. Обзор литературы).В нашей работе мы проанализировали экспрессию гена RR4 на разных срокахразвития клубенька и обнаружили, что максимум экспрессии MtRR4 попадает на12 дпи, то есть совпадает с наблюдаемым нами максимумом экспрессии генаMtKNOX3 (Рисунок 18). Это можно рассматривать как дополнительноесвидетельство возможной связи гена MtKNOX3 с активацией цитокининого ответапри развитии клубеньков.74Рисунок 18 - Временная динамика экспрессии гена цитокининного ответа MtRR4и гена MtKNOX3 при клубенькообразовании.3.2.1.
Поиск последовательностей генов, кодирующих IPT M. truncatula, вбазах данных, подбор праймеровДля проверки предположения о том, что ТФ KNOX могут активироватьэкспрессию MtIPT при развитии клубенька, прежде всего, необходимопроанализировать экспрессию самих генов MtIPT при формировании клубеньков.ГеномMedicagotruncatula(Mt4.0v1)содержит23последовательности,аннотированные как изопентенилтрансферазы (IPT), две пары которых являютсясовершенноодинаковымипоследовательностями(Medtr6g045287/Medtr6g045293 и Medtr3g020100 / Medtr3g020155). Среди 21 неповторяющихсяпоследовательностей имеются две последовательности, кодирующие усеченныепептиды (Medtr7g007180 и Medtr7g007190 с 57 и 59 аминокислотамисоответственно).
Было построено филогенетическое дерево с использованиемнуклеотидных последовательностей генов IPT у M. truncatula, A. thaliana илядвенца L. japonicus (Рисунок 19). Согласно этому дереву 6 генов MtIPTгруппируются в месте с генами IPT арабидопсиса и лядвенца, которые были наминазваны в соответствии с их близкими ортологами у лядвенца и арабидопсиса.Таким образом, Medtr1g110590 был назван как MtIPT1, Medtr4g117330 как75MtIPT2, Medtr1g072540 как MtIPT3, Medtr2g022140 как MtIPT4, Medtr4g055110как MtIPT5, Medtr2g078120 как MtIPT9.
Также была выявлена уникальная группагенов MtIPT, близких гомологов которой нет у арабидопсиса и лядвенца,последовательности которых очень схожи между собой. Эта группа содержит 15генов MtIPT M. truncatula с 52,6% идентичности и 95,45% консенсусных позиций.Рисунок 19 - Дерево, иллюстрирующее степень сходства последовательностейгенов IPT арабидопсиса и лядвенца с последовательностями их предполагаемыхгомологов у Medicago truncatulа.76К последовательностям, кодирующим гомологи IPT у M.truncatula, былиподобраны праймеры для последующего анализа экспрессии генов (см.Приложение 15). С подобранными праймерами были получены фрагментыожидаемого размера на матрице ДНК люцерны.3.2.2.
Анализ экспрессии генов MtIPT на разных стадиях развитияклубеньков с помощью количественной ПЦР в реальном времениМы проанализировали экспрессию идентифицированных генов IPT улюцерны в разные дни после инокуляции и выявили активацию экспрессииMtIPT1, MtIPT2, MtIPT3, MtIPT5, MtIPT9 в ответ на инокуляцию ризобиями(Рисунок 20). Экспрессия других проанализированных генов IPT, в том числеэкспрессиигеновизуникальнойгруппынеувеличиваетсяприклубенькообразовании.Рисунок 20 - Уровни экспрессии генов MtIPT1(А), MtIPT2(Г), MtIPT3(Б),MtIPT4(В), MtIPT5(Д), MtIPT9(Е) на разных сроках развития клубеньков (1-22дни после инокуляции (dpi), NI-3d, NI-5d и NI-7d – контроли без инокуляции).77Мы обнаружили, что экспрессия генов MtIPT в основном активируется в ответна инокуляцию на 7 день и максимум их экспрессии обычно наблюдается на 9дпи.УарабидопсисаAtIPTпредставляетсобойсемействогеновиз8представителей, из них AtIPT1, 3, 5, 7 экспрессируются в корнях.
Политературным данным известно, что ген AtIPT1 экспрессируется в прокамбиикорня арабидопсиса, AtIPT3 экспрессируется в флоэме и перицикле корня, AtIPT5экспрессируется в клетках колумеллы. AtIPT2 и AtIPT9 представляют собойтРНК-изопентенилтрансферазы.экспрессировалисьповсеместноATIPT2::сболееGUSиAtIPT9сильной::экспрессиейGUSвпролиферирующих тканях, включая корни и апикальные меристемы и зачаткилистьев (Miyawaki, et al., 2004).
У L. japonicas наибольший уровень экспрессииLjIPT3,4,5 наблюдается в корнях. Также показано увеличение экспрессииLjIPT1,2,3,4 при клубенькообразовании (Chen, et al., 2014)Reid et al., 2107.Таким образом, нами был обнаружен предполагаемые гомологи генов IPT1, 2,3, 5,9 у люцерны, экспрессия которых усиливается в развивающихся примордияхклубеньков на 7 и 9 день после инокуляции.3.2.3. Поиск последовательностей генов, кодирующих LOG у M. truncatula, вбазах данных, подбор праймеровС помощью алгоритма BLAST на основании известных последовательностейгенов LOG у Arabidopsis thaliana в базе данных NCBI и medicago.org былинайдены схожие последовательности предполагаемых гомологов генов LOG у M.truncatula.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
