Диссертация (1145887)
Текст из файла
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТНа правах рукописиКРУГЛОВАНаталья МихайловнаБелки плотных контактов секреторного эпителиямолочной железы мыши03.03.01 – физиологиядиссертацияна соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:д.б.н. проф. А.Г. МарковСанкт-Петербург20182ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОКСОКРАЩЕНИЙ……………………………………………………………..4ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………………..5ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………...10ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………….........432.1.
Подготовка и обработка экспериментального материала……………………432.2. Определение белков плотных контактов методом Вестерн-блота…………..442.3. Изучение гистологической структуры препаратов ткани молочнойжелезы с помощью световой микроскопии…………………………………….......472.4. Иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов дляизучения локализации белков плотных контактов…………………………….......482.5.
Исследование ткани молочной железы с помощью электронноймикроскопии…………………………………………………………………….........482.6. Определение активности миелопероксидазы………………………………….492.7.Статистическая обработка………………………………………………………50ГЛАВА 3. ПЛОТНЫЕ КОНТАКТЫ И СПЕКТР КЛАУДИНОВ ВЭПИТЕЛИИ АЛЬВЕОЛЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ………………………………513.1.
Плотные контакты в структуре альвеолы молочной железы……………......513.2.Локализация белка-маркера плотных контактов окклюдина…………………533.3. Определение белков плотных контактов в ткани молочной железымышей методом Вестерн-блотинга…………………………………………………563.4. Локализация белков плотных контактов в эпителиимолочной железы……………………………………………………………………593.5. Обсуждение полученных результатов…………………………………………59ГЛАВА 4. ПЕРЕРЫВ В КОРМЛЕНИИ ДЕТЕНЫШЕЙ МЫШИ КАКМОДЕЛЬ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА РАСТЯЖЕНИЯАЛЬВЕОЛ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ………………………………………................6834.1. Изменение структуры альвеол молочной железы при перерывев кормлении детенышей…………………………………………………………….684.2 Изменение ультраструктуры эпителиальных клеток альвеол молочнойжелезы мыши после длительного перерыва в кормлении ……………………….714.3.
Изучение активности миелопероксидазы в ткани молочной железы мышей 734.4. Обсуждение полученных результатов ………………………………………..73ГЛАВА5.ВЛИЯНИЕДЛИТЕЛЬНОГОПЕРЕРЫВАВКОРМЛЕНИИДЕТЕНЫШЕЙ НА УРОВЕНЬ, ЛОКАЛИЗАЦИЮ КЛАУДИНОВ И ДЛИНУПЛОТНЫХ КОНТАКТОВ В МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ МЫШИ ………………….765.1. Изменение уровня белков плотных контактов в молочной железемыши при перерыве в кормлении детенышей …………………………………….765.2. Изучение локализации белков плотных контактов в молочнойжелезе мыши при перерыве в кормлении детенышей ……………………………765.3. Изменение длины плотных контактов эпителиоцитов молочнойжелезы при длительной отсадкедетенышей ………………………………………835.4. Обсуждение полученных результатов ………………………………………..85ЗАКЛЮЧЕНИЕ ……………………………………………………………………..93ВЫВОДЫ ……………………………………………………………………………97СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………………………………..984СПИСОК СОКРАЩЕНИЙАКТГ − адренокортикотропный гормонБСА – бычий сывороточный альбуминMDCK – клетки Мадин-Дарби почек собак (Madin-Darby canine kidney)MDA-MB 361 − линия опухолевых клеткок молочной железыPBS – phosphate buffer salinePTHrP – паратгормон–связанный протеинSDS – sodium dodecyl sulfate- додецилсульфат натрияTAMP – белки Марвел, ассоциированные с плотными контактами(tight-junction associated Marvel protein)TBS – TRIS-buffer SalineмРНК – матричная рибонуклеи́новая кислота́НС11 – линия эпителиальных клеток молочной железы мышейПВДФ – поливинилденфторидТЭРП – трансэпителиальная разность потенциаловц ГМФ – циклический гуазинмонофосфатцАМФ – циклический аденозинмонофосфатЭГТА – этиленгликольтетрауксусная кислотаЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота5ВВЕДЕНИЕАктуальность темы исследования.
Тканевые барьеры в организмеотделяютвнутреннююсредуотокружающейсреды,обеспечиваюткомпартментализацию протекающих процессов в различных органах, а такжепредотвращают проникновение патогенов в организм. Ключевой структурой,которая вносит вклад в создание тканевых барьеров, являются эпителиальныеклетки, соединенные плотными контактами (Van Itallie, Anderson, 2014). Этиструктурыявляютсяапикальнойобластимежклеточнымиплазматическихкомплексами,мембранирасположеннымисоединяющиевсоседниеэпителиоциты (Krug et al., 2014). Выделяют несколько функций, присущих этимструктурам: определение функциональной полярности эпителиальных клеток;формированиеподдержаниепарацеллюлярногоструктурнойОпределяющийвкладвбарьерадляионовцелостностиэпителияселективныймежклеточныйи(Markovмакромолекул;etal.,транспорт2015).вносятинтегральные белки семейства клаудина, формирующие межклеточные заряд- иразмер-селективные поры (Krug et al., 2014).
Часть этих белков (клаудины-1,-3,-4,5,-8),увеличиваянепроницаемостьплотныхконтактов,уменьшаютпарацеллюлярный транспорт (Furuse et al., 2002; Milatz et al., 2008), другие(клаудины-2, -12, -15 и -16) могут формировать селективные ионные поры(Amasheh et al., 2002; Fujita et al., 2008). Однако, вклад этих белков в поддержаниецелостности эпителиального пласта, в первую очередь при механическихвоздействиях на него, остается вопросом не изученным.Секреторный эпителий альвеол молочной железы представляет собойперспективнуюфизиологическуюмодельизучениявкладаклаудиноввцелостность эпителиального пласта при механических воздействиях in vivo.Альвеола,состоящаяизодногослояэпителиальныхклеток,являетсяморфофункциональной единицей молочной железы, в которой происходятосновные этапы образования секрета.
Необходимым условием, позволяющим6сформировать секрет, является отсутствие обратного транспорта органическихвеществ и ионов из полости альвеолы (Толкунов, Марков, 2005). Важную роль вотделении полости альвеолы от межклеточного пространства, т.е. в созданиитканевого барьера, а также в объединении секреторных клеток в составеальвеолы, выполняют плотные контакты, расположенные в апикальной областижелезистого эпителия (Ngyuen, Neville, 1998).Секреторныеклеткивпроцесселактациииспытываютсильноемеханическое воздействие. С базальной стороны альвеол оно обусловленопериодическим сокращением миоэпителиальных клеток (Марков, 2002). Приперерыве в кормлении детенышей молоко скапливается в полости альвеол иможет оказывать механическое давление с апикальной стороны эпителия альвеол.Сохранение целостности альвеолы в этот момент является необходимымусловием для нормального функционирования молочной железы (Stelwagen et al.,1997).
Кроме этого, к началу лактации между эпителиоцитами исчезаютдесмосомы и адгезионные контакты, при сохранении плотных контактов (Pietelkaet al., 1973). В этой ситуации именно плотные контакты становятся межклеточнойструктурой, обеспечивающей целостность альвеолы молочной железы примеханическихвоздействиях.Сочетаниеэтихфакторовявляетсяважнойпредпосылкой для решения поставленной задачи по изучению вклада белковплотных контактов в сохранении структуры эпителиального пласта.Поскольку мыши относятся к животным, у которых отсутствуют синусы ицистерны, необходимые для накопления секрета, все молоко находится именно вальвеоле (Alekseev et al., 1992). В качестве рабочей гипотезы предполагали, чтоувеличение секрета в полости альвеолы может приводить к разъединениюсоставляющих ее эпителиальных клеток.
Создание условий, при которыхпроисходит значительное накопление секрета, позволит выявить клаудины,необходимые для сохранения функциональной целостности альвеолы.До настоящего времени не проведен комплексный анализ спектраклаудинов в секреторных клетках альвеол молочной железы мышей. В опытахиспользовали линии клеток молочной железы (Kominsky et al., 2004; Reiter et al.,72006) и ткань молочной железы мыши (Blanchard et al., 2006, Kobayashi et al.,2013).
Однако, в этих исследованиях не проводили широкого анализа спектраклаудинов в ткани молочной железы и ограничивались одним из молекулярнобиологических методов их определения. Кроме этого, данные, полученные налиниях клеток, не всегда отражают характер распределения белков в нативнойткани. Выяснение молекулярного многообразия клаудинов существенно дляпонимания механизмов формирования ионного состава молока в полостиальвеолы.Таким образом, целью данного исследования было изучение молекулярногосостава клаудинов, входящих в структуру плотных контактов секреторногоэпителия альвеол молочной железы мыши, и изменения в их уровне илокализации после длительного перерыва в кормлении детенышей.Задачи исследования:1.Исследовать спектр клаудинов и их локализацию в секреторномэпителии альвеол молочной железы мыши2.Разработать физиологический метод механического растяженияальвеол молочной железы3.Оценитьизменениеультраструктурысекреторногоэпителия,размеров альвеол молочной железы и параметров местной воспалительнойреакции при длительном перерыве в кормлении детенышей4.Изучить содержание клаудинов и окклюдина в секреторном эпителиимолочной железы мышей при длительном перерыве в кормлении детенышейНаучная новизна.
Впервые для исследования плотных контактов эпителиямолочной железы мыши был применен комплексный подход, включающий в себямолекулярно-биологические, электронно-микроскопические и иммунохимическиеметоды. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что в эпителиимолочной имеются белки, способствующие межклеточному транспорту, и белки,ограничивающие проницаемость эпителия. Впервые методом Вестерн-блота ииммуногистохимическим методом установлено наличие в эпителии альвеолмолочной железы клаудина-2, -5, -8, -12, -15 и -17. Впервые установлено, что8перерыв в кормлении на протяжении двадцати часов не вызывает развитиявоспалительных процессов в эпителии молочной железы.
Приоритетнымиявляются результаты о снижении клаудина-2 и -16 при накоплении секрета вполости альвеолы молочной железы. Получены принципиально новые данные обувеличении уровня клаудина-1 и -3 при механическом воздействии насекреторный эпителий. Впервые показано, что накопление секрета в полостиальвеолмолочнойжелезывлияетнауровеньклаудинов,изменяющихмежклеточную проницаемость эпителия и сохраняющих целостность альвеолмолочной железы.Теоретическая и практическая значимость работы. В настоящей работепредложен новый комплексный подход к анализу роли тканевых барьеров вмежклеточном взаимодействии, что имеет важное фундаментальное и прикладноезначение. Полученные данные углубляют наши представления о возможныхмеханизмах формирования секрета молочной железы в полости альвеолы.
Наосновании проведенных исследований обосновывается положение о том, чтоплотные контакты вносят свой вклад в поддержание целостности эпителиальныхструктур при длительном механическом воздействии. Проведенные исследованияимеют важное значение для обоснования предположения о плотных контактах какфункциональном кластере взаимосвязанных белков. Практическая значимостьработы определяется возможность прогноза развития дисфункций молочнойжелезы, связанных с изменением уровня или спектра этих белков в плотныхконтактах. Результаты диссертации входят в курсы по физиологии, читаемые набиологическомфакультетеСанкт-Петербургскогогосударственногоуниверситета.Положения, выносимые на защиту:1.Молекулярнымикомпонентамиплотныхконтактовэпителиямолочной железы мыши являются порообразующие клаудины, а также клаудины,формирующие барьер для парацеллюлярного транспорта.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
