Диссертация (1145887), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Определение активности миелопероксидазыМиелопероксидазаявляетсялизосомальнымферментом,которыйсодержится в азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов, и можетслужить маркером клеток миелоидного ряда. Увеличение активности данногофермента в молоке свидетельствует об усилении миграции нейтрофилов впроцессе развития воспалительной реакции.Метод основан на окислении О-дианизидина перекисью водорода вприсутствии миелопероксидазы.Для определения общей пероксидазнойактивности пробы ткани молочной железы взвешивали с точностью до 0,1 мг,гомогенизировали в 0,1М цитратнофосфатном буфере (pH=5,7) из расчета 10 мгткани в 1.5 мл. буфера.50Полученные тканевые гомогенаты центрифугировались в течение 25 мин.при 500g.
Пероксидазную активность определяли по скорости окисления одианизидина в отобранной надосадочной жидкости. Для этого использовали0,02М раствор о-дианизидина в метаноле, который вносили в кюветыспектрофотометра вместе с пробами. Общую пероксидазную активность тканейоценивали в относительных о-дианизидиновых единицах (о.д.е.), принимая заодну единицу изменение оптической плотности на 0,001 в течение 1 мин.
придлине волны 460 нм.2.7.Статистическая обработкаСтатистическая обработка результатов проводилась с использованиемкомпьютерной статистической программы GraphPad.Prism.v5.00. Полученныерезультаты выражали в процентах от контрольной группы. Для расчетовиспользовали программу Microsoft Excel, рассчитывали среднее и стандартнуюошибку.
При обработке результатов использовали парный t-критерий Стьюдента.В опытах, в которых по методическим причинам приходилось ограничиватьсянебольшим количеством измерений, применяли непараметрический критерийМанн-Уитни. Уровень достоверности р < 0,05 был принят как статистическизначимый.51ГЛАВА 3. ПЛОТНЫЕ КОНТАКТЫ И СПЕКТР КЛАУДИНОВ ВЭПИТЕЛИИ АЛЬВЕОЛЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ3.1. Плотные контакты в структуре альвеолы молочной железыСветовая микроскопия. Молочная железа контрольной группы мышейпредставлена пластом железистой ткани. Основу железистой ткани составляютальвеолы разной величины, собранные в группы, которые окружены прослойкамисоединительной ткани.
Такие группы, в свою очередь, образуют более крупныеструктуры молочной железы – доли. Каждая доля отделена от другойзначительнымслоемсоединительнойткани.Напрепаратаххорошоидентифицируются кровеносные сосуды, расположенные во всех тканяхмолочной железы. Жировая ткань практически отсутствует. По данным световоймикроскопии совокупность морфологических признаков молочной железы тканиживотных, взятых в эксперимент, характерна для ее нормального развития впериод лактопоэза (Рис.
1, А).Альвеолы молочной железы образованы однослойным эпителием, размерыклеток которого варьируют в пределах альвеолы. В клетках расположеныкрупные ядра, характерные для секреторных клеток. Эпителиоциты плотноприлегают своими базолатеральными поверхностями друг к другу, формируяполость альвеолы. В полости альвеолы определяются жировые капли. Контуральвеол ясно очерченный (Рис. 1, Б).Электронная микроскопия. Особенности ультраструктуры секреторногоэпителиямолочнойжелезыпозволяютчеткоидентифицироватьнаэлектронограммах апикальную и базальную часть клеток. На фотографиях,полученных с помощью электронного микроскопа, видно, что на поверхностиклеток, обращенной в полость альвеолы, есть микроворсинки.
В апикальной частиклеток находятся секреторные везикулы, которые ограничены мембраной. Ядро вклеткахсекреторногоэпителиясмещенок базальнойобласти.В немопределяются обширные зоны эухроматина, что характерно для активносинтезирующих клеток.52Рис. 1. Структура альвеолы и ткани молочной железы мышиА – строение молочной железы мыши (окраска гематоксилин-эозином).Б – строение альвеолы молочной железы (окраска толлуидиновым синим).Эп – эпителий, КС – кровеносный сосуд, ПА – полость альвеолы,ЛК – липидные капли, СТ – соединительная ткань53Электронограммыпозволяютпроанализироватьтипымежклеточныхконтактов в эпителии молочной железы. На боковых поверхностях соседнихклеток не обнаружены зоны адгезии и десмосомы. Клетки объединены междусобойдругими типами межклеточных контактов.
Стоит отметить наличие налатеральной плазмалемме клеток интердигитаций – соединений по типу «замка»,образующихся в результате инвагинации плазматических мембран соседнихклеток (Рис. 2. А).В апикальной области секреторных клеток на всех электронограммахальвеол хорошо видны плотные контакты. Они определяются как электронноплотные структуры в местах соединения апикальных участков плазматическоймембраны соседних клеток. Характерной чертой строения плотных контактовявляетсякажущеесяприводящеекслияниеисчезновениюплазматическихвэтомучасткемембрансоседнихвидимогоклеток,межклеточногопространства. В то время как в базолатеральной области между соседнимиклетками оно хорошо просматривается.
Обнаруживается определенная дляэпителиальных клеток альвеол закономерность в расположении плотныхконтактов и микроворсинок. В зоне плотного контакта, на мембранах соседнихклеток, всегда есть микроворсинки. На остальной части апикальной мембраны ихможет не быть или они редко расположены. В полости альвеол различимыгранулы казеина (Рис. 2. Б).3.2.Локализация белка-маркера плотных контактов окклюдина.Дляиммуногистохимическойидентификацииплотныхконтактоввальвеолах молочной железы изучали распределение меченых антител кокклюдину.
Данный белок является необходимым молекулярным компонентомплотных контактов, поэтому его используют в качестве маркера этих структур(Furuse et al., 1993).Применение антител к окклюдину выявляет в секреторных клетах сетьплотных контактов. Сопоставление свечения окклюдина относительно ядра54клетки и полости альвеолы указывает на расположение этого белка в апикальнойчасти цитоплазматической мембраны секреторных клеток альвеолы.Рис. 2. Ультраструктура секреторного эпителия молочной железы мышиА– общий вид эпителиальных клеток. Б – ультраструктура эпителиальной клетки взоне плотного контакта.ПА – полость альвеолы, ПК – плотный контакт, Мв – микроворсинки, ГК – гранулыказеина, СГ – секреторные гранулы, Ид – интердигитации, МП – межклеточноепространство.55Рис.3.
Локализация окклюдина – белка-маркера плотных контактов56Характер расположения метки (свечение окклюдина) на препаратах зависитот плоскости прохождения среза через эпителий. Если срез прошел строгогоризонтально в апикальной области клетки, токонфигурация свеченияокклюдина показывает, что он опоясывает клетку по периметру (Рис. 3. А). Еслисрез прошел вертикально, по направлению апикально-базальной оси клетки,окклюдин виден как отдельные повторяющиеся точки на определенномрасстоянии одна от другой (Рис. 3.
Б).При прохождении среза под углом к апикальной поверхности клеток,окклюдин обнаруживается в виде тонкой изогнутой линии, расположенной вапикальной части секреторных клеток и отделяющей клетку от полости альвеолы(Рис. 3.В). Свечение белка-маркера окклюдина является предпосылкой дляопределения локализации клаудинов в апикальной мембране секреторногоэпителия альвеол молочной железы.3.3. Определение белков плотных контактов в ткани молочной железымышей методом Вестерн-блотингаВ ткани молочной железы при исследовании методом Вестерн-блотингабыли выявлены клаудин-1, -2, -3, -4, -5, -7, -8, -12, -15, -16 и -17, а такжеокклюдин. Окклюдин идентифицировался как белок с молекулярным весом 60-65кДа; клаудин-1, -2, -3, -7, -8 и -17 – как белки с молекулярным весом 22 кДа;клаудин-4, -5 и -15 имели молекулярный вес 24 кДа; клаудин-11 и -12 – 26 кДа(Рис.
4).Анализ результатов проведения Вестерн-блота свидетельствует о том, чточастотаобнаруженияотдельныхклаудиноввтканимолочнойжелезыразличается. По данному параметру клаудины можно разделить на две группы. Кпервой группе относятся те белки, которые обнаруживаются во всех пробахткани, то есть, их следует считать конститутивными молекулярным компонентамплотных контактов в молочной железе.
К ним относятся клаудин-1, -4, и -16.Стоит подчеркнуть, что окклюдин, который рассматривают как белок-маркер57плотных контактов, также идентифицировали во всех опытах. Другие клаудины, аименно клаудин-2, -3, -5, -7, -8, -12, и -15, определяются не в каждой пробе тканимолочной железы, поэтому их можно отнести к индуцибельным компонентамплотных контактов, то есть появляющимся при определенных условиях. В этугруппу входят клаудин-2, -3, -5, -7, -8, -12, и -15.Рис. 4.
Спектр клаудинов в ткани молочной железы мышей58Рис.5.Локализация белков плотных контактов в эпителии альвеолымолочной железыА – определение клаудина – 8, Б – определение клаудина – 16 в зоне плотногоконтакта.Зеленое свечение – окклюдин; красное свечение – клаудин; желтое свечение –интерференция зеленого и красного – совместная локализация клаудина иокклюдина593.4. Локализация белков плотных контактов в эпителии молочнойжелезыИммунофлуоресцентную микроскопию использовали для исследованиялокализации белков плотных контактов в ткани молочной железы. Использованиеметодаиммунофлуоресфенциииконфокальнойсканирующейлазерноймикроскопии позволило определить расположение белков плотных контактов вэпителии альвеолы молочной железы.
Клаудины локализовались в пределахплотных контактов эпителия, о чем свидетельствует наличие желтого свечения наимиджах (Рис. 5).3.5. Обсуждение полученных результатовМолекулярный состав плотных контактов в ткани молочной железы.Полученные результаты свидетельствуют, что в период лактации в апикальнойчасти эпителия альвеол молочной железы мышей сформированы плотныеконтакты, объединяющие секреторные клетки в единую структуру. Спектрклаудинов, которые обнаружены в плотных контактах эпителия альвеолымолочной железы, представлен различными членами этого семейства белков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
