Диссертация (1145887), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Представительство клаудинов в различных клеточных линияхэпителия молочной железыМетод определенияВестерн-ИммуногистохимияблотКлдн-1ЛинияДНК-клетокгибр.HMECПЦРмикроскопиякопияHMECReiter et al., 2006Reiter et al., 2006Tokés et al., 2005a+HMECKominsky et al.,–2004+Reiter et al., 2006HMEC+HMEC+HC11+Клдн-5HC11+Клдн-7EPH4+HMEC+Клдн-8Tokés et al., 2005a–HMECHMECTokés et al., 2005a+HC11АвторыKrämer et al., 2000+HC11Клдн-4микрос+HC11Клдн-3световая+HMECКлдн-2лазернаяTokés et al., 2005a++Kominsky.et.al.,2004Reiter et al., 2006Reiter et al., 2006–Blackman et al.,2005Tokés et al., 2005aHC11+Kominsky et al.,2003Reiter et al., 2006HC11+Reiter et al., 2006+28Клдн-10HC11–Reiter et al., 2006Клдн-14HC11–Reiter et al., 2006Клдн-15HC11+Reiter et al., 2006Клдн-16HC11+Reiter et al., 2006Клдн-18HC11–Reiter et al., 2006«+» - использование метода, который дал положительный ответ на наличиеклаудинов;«–» – использование метода, при котором не была подтверждено наличиеданного клаудина.Клаудинывсекреторномэпителиимолочнойжелезывпериодгалактопоэза.
По данным, приведенным в литературе, в секреторном эпителиимолочной железы на сегодняшний день обнаружена экспрессия несколькихклаудинов.Предполагаявозможныевидовыеособенностираспределенияклаудинов в ткани молочной железы, данные проанализированы отдельно дляразличных животных и человека.Для отдельных видов животных данные об экспрессии клаудиновнемногочисленны. Так, для эпителия молочной железы кошки с помощьюсветовой иммуногистохимии показано наличие клаудина-2 (Flores et al., 2014).Аналогичным методом идентифицированы клаудин-1, -2, -3, -4, -5, -7 и -10 вэпителии молочной железы собаки (Jakab et al., 2008). Следует отметить, чтопредставленные изображения ткани молочной железы не позволяют считатьубедительно доказанным наличие и локализацию этих белков в ткани молочнойжелезы.В ткани молочной железы крысы изучение экспрессии генов клаудина,наличия транскриптов, уровня различных клаудинов с помощью Вестерн-блота,практически не проводили.
При исследовании процессов канцерогенеза, вкотором в качестве контрольных образцов использовали ткань молочной железыкрысы, показано наличие в ней мРНК клаудина-6 (Quan, Lu, 2003). Эти данныепредставляют определенный интерес, так как клаудин-6 в эпителии молочной29железы или на клеточных линиях молочной железы не изучали.Исключениеклаудина-6 из сферы интересов, при изучении ткани молочной железы, можетбыть связано с предположением о том, что клаудин-6 участвует,в основном, впроцессе эмбрионального развития.Немногочисленны исследования клаудинов в нормальной ткани молочнойжелезы человека. Выделена комплементарная ДНК (кДНК) клаудина-1 изэпителиальных клеток молочной железы человека (Krämer et al., 2000).Определение содержания клаудинов в ткани молочной железы женщиныпроводили, исследуя образцы ткани без признаков аномального развития,полученные в ходе маммопластики или оперативных вмешательств.
Методомсветовой микроскопии было установлено наличие клаудина-3, -4 и -7 в тканимолочной железы женщины (Kominsky et al., 2003; 2004).В большей степени изучен эпителий молочной железы лабораторныхмышей, как одного из основных видов экспериментальных животных (Табл.
3).Таблица 3. Представительство клаудинов в эпителии молочной железымышиМетод определенияДНКгибр.Клдн-1+ИммуногистохимияПЦРВестернблот+Клдн-2+световаямикроскопия+–Клдн-3лазернаямикроскопияBlanchard et al., 2006–Kobayashi, Kumura, 2011–Kobayashi et al., 2013+Blackman et al., 2005–Kobayashi, Kumura, 2011+++Авторы+Blanchard et al., 2006Kobayashi, Kumura, 201130+Клдн-4+++++Kobayashi, Kumura, 2011++Kobayashi et al., 2013–Kobayashi, Kumura, 2011+Blackman et al., 2005–Kobayashi, Kumura, 2011+Kobayashi et al., 2013–Kobayashi, Kumura, 2011++Клдн-10Blanchard et al., 2006+Клдн-5Клдн-7Kobayashi et al., 2013+«+» - использование метода, который дал положительный ответ на наличиеклаудинов;«–» – использование метода, при котором не была подтверждено наличиеданного клаудина.Клаудин-3 и -4 определяется всеми методами в ткани молочной железы иегоналичиеподтверждаетсянезависимымиисследованиямиавторовизразличных лабораторий (Blanchard et al., 2006; Kobayashi, Kumura, 2011;Kobayashi et al., 2013).
Наличие клаудина-1 и-7 также исследовали различнымиметодами, хотя в каждом исследовании использовали какой-либо отдельныйметод. Помимо результатов, подтверждающих наличие клаудина-1 и -7 в тканимолочной железы, были получены данные об его отсутствии (Blanchard et al.,2006; Kobayashi, Kumura, 2011; Kobayashi et al., 2013; Blackman et al., 2005).Клаудин-2, -5 и -10 определяли только иммуногистохимическим методом. Данныеметодический прием не выявил этих белков в секреторных клетках молочнойжелезы (Kobayashi, Kumura, 2011).
Таким образом, комплексного изученияналичия белков плотных контактов в эпителии молочной железы не проводили.Можно утверждать, что данные по этим белкам отрывочны и фрагментарны.31При изучении функций плотных контактов на животных, определяяизменение концентраций ионов натрия и лактозы в плазме крови и молоке,основной акцент делали на изучение барьерной функции плотных контактов. Подэтим подразумевается, что плотные контакты ограничивают парацеллюлярнуюдиффузию ионов и органических молекул, изолируя полость альвеолы оттканевой жидкости. Решающий вклад в изоляцию полости альвеолы могутвносить клаудин-1, -3 и -4, которые во всех исследованиях обнаружены вэпителии альвеол молочной железы в период установившейся лактации.Отсутствиеданныхоналичииклаудина-2и-16,формирующихмежклеточные поры для диффузии ионов, не позволяет анализироватьтранспортную функцию плотных контактов, их участие в формировании секрета вполости альвеолы.Достаточно интенсивно обсуждалась в литературе возможная функцияклаудина-7 в ткани молочной железы.
С помощью лазерной сканирующеймикроскопии было установлено,что белок полностью локализован в базолатеральных районах цитоплазмы, где он определялся как пятна, не будучи строгосвязан с клеточной границей. Клаудин-1, как контрольный белок, быллокализован в плотных контактах. Авторы предполагают участие клаудина-7 ввезикулярном трафике к базо-латеральной мембране. Клаудин-7 возможностабилизирует везикулы или участвует во взаимодействии клетка-матрикс(Blackman et al., 2005). В последующих работах было подтверждено, что клаудин7неко-локализовансбелком-маркеромокклюдином,поэтому авторыутверждают, что клаудин-7 расположен не в зоне плотных контактов (Kobayashi,Kumura, 2011). Имеется еще одна гипотеза относительно того, почему нанекоторых стадиях лактации отдельные клаудины не локализованы в зонеплотных контактов.
Предполагают, что они могут участвовать в ремоделированииплотных контактов в различные стадии развития молочной железы (Blanchard etal., 2006).Вклад белков плотных контактов в молекулярные механизмы сохраненияцелостностиэпителиальногослоядонастоящеговременинеизучен.32Исследования в этом направлении могут быть важными для понимания развитияопухолевогороставтканимолочнойжелезы.Переходклеткииздиффернцированного состояния в де-дифференцированное может происходитьтолько при разрушении межклеточных, в том числе и плотных, контактов. Так,мембранныйицитоплазматическийпаттерниммуноцитохимическогоокрашивания наблюдался при исследовании в клаудин-1-трансдуцированныхMDA-MB 361 опухолевых клетках молочной железы.
При этом наиболеевыраженная его локализация на мембране коррелировала с более явнымувеличением апоптоза в опухолевых клетках. Авторы заключили, что потерямембранной локализации клаудина-1 может быть важным шагом в опухолевойпрогрессии (Hoevel T. et al., 2004).Изменение уровня клаудинов в процессе дифференцировки ткани молочнойжелезы при беременности, лактации и инволюции. Секреторный эпителиймолочной железы – это динамично развивающаяся структура. Массивнаяперестройка ткани молочной железы в течение беременности приводит кобразованию секреторных лобулоальвеолярных субъединиц при подготовке клактации.Начальнаяпролиферативнаяфазаальвеолярногоморфогенезавызывается увеличением уровня сывороточного пролактина и прогестерона.
Этигормоны активируют генетическую программу, которая координирует изменениявэпителиимолочнойжелезы,такиекакпролиферация,миграция,дифференцировка и гибель клеток во многих типах ткани молочной железы. Вфазу альвеолярного морфогенеза происходит быстрая и массивная пролиферацияэпителиальных клеток внутри ветвей протоков и развивающихся альвеол, чтодолжно обеспечивать достаточную продукцию молока в течение лактации. Умышей, начиная с середины беременности, доминирует уже дифференцировкаклеток, поскольку железа переходит к секреторной фазе.
Альвеолярные клеткистановятся поляризованными и формируют сфероподобный одиночный слойэпителиальныхклеток,окружающийпросвет.Приэтомпроисходитиобразование плотных контактов, которые стабилизируют данную структуру.Другой важный аспект функционирования молочной железы в течение онтогенеза33заключается в ее периодическом развитии и инволюции, т.е. в цикличности.После развития железы и фазы лактации происходит переключение напрограммированную клеточную гибель во время инволюционной фазы. Впоследующие беременности все эти перестройки повторяются (Oakes et al., 2006).Таким образом, молочная железа – это динамично развивающийся орган, которыйфункционирует с определенной периодичностью. Поэтому ясно, что должнысуществовать специальные механизмы и структуры, которые участвуют в этойперестройке и способствуют поддержанию главной функции молочной железы выработке, накоплению секрета и его выведению.
Вследствие этого, былипроведены исследования белков плотных контактов в молочной железе уживотных, находящихся на стадии беременности и лактации.Проведенные исследования показали, что уровень экспрессии некоторыхклаудинов изменялся в ходе развития молочной железы от периода беременностидоинволюции.Приисследованииклаудинов-1,-3,-4спомощьюиммуноцитохимии и real-time PCR было показано, что экспрессия клаудина-1 и 4 увеличивалась в ходе беременности, затем резко снижалась к десятому днюлактации и снова значительно возрастала к первому дню инволюции.
В то жевремя, клаудин-3 показал устойчивоеувеличениев экспрессии от периодабеременности до инволюции (Blanchard et al., 2006). В другом исследовании, приизучении экспрессии клаудина-7в молочной железе мышей, показали, чтоэкспрессия гена клаудина-7 в молочной железе фертильных особей увеличиваласьболее чем в тысячу раз по сравнению с железой в периоде ранней лактации,выравниваясь в течение лактации и снижаясь на поздних стадиях инволюции(Blackman et al., 2005). Таким образом, можно предположить, что различныечлены семейства клаудинов могут быть функционально важнымив разныепериоды развития молочной железы, внося различный вклад в ее функции.Количество транскриптов мРНК клаудина-7 интенсивно растет во времялактации (существенные изменения).
Во время беременности происходитбыстрый рост их числа. Начиная со второго дня лактации до 29 дня лактации наотносительно стабильном уровне. Для того, чтобы определить является ли34экспрессия клаудина-7 функция стадии развития или количества эпителиальныхклеток, также отслеживали количество транскриптов для кератина-19, найденноготолько в секреторных клетках альвеол. Этот подход подтвердил, что количествоклаудина-7 растет при увеличении массы железы, а также увеличении клетокальвеолярного эпителия.
(Blackman et al., 2005).Очень большие изменения в уровнях экспрессии в ходе беременности,наиболее вероятно, отражают увеличение количества клеток, так как эпителиймолочной железыувеличивается в объеме из системы разбросанных по«наивной» железе протоков до плотной массы лактирующих клеток железы, изкоторой жировая ткань уже большей частью исчезла.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
