Диссертация (1145887), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Время, в течение которого самки кормят детенышей,равняется 14 ч и состоит из повторяющихся периодов (от 30 до 60 мин)кормления. Выяснено, что при кормлении детенышей происходит регулярноекратковременное повышение уровня окситоцина в крови самок с интервалом в 4-5мин в течение этого периода (Марков, 1989, 1991, 1992, 2001.). Сокращениемиоэпителиальных клеток, в ответ на повышение уровня окситоцина в плазмекрови при кормлении детенышей, приводит к периодическому сжатию альвеолы(Moore et al., 1987; Марков, 2001).39Эта модель изучения механического воздействия на секреторные клетки несовсем адекватна, так как окситоцин одновременно влияет на ионные процессы вмолочной железе (Толкунов, 1987).Накопление молока как способ изучения механического влияния на функцииплотных контактов. Одним из основных методических приемов, позволяющихвызвать изменение проницаемости эпителия молочной железы, являетсянакопление секрета в молочной железе при прекращении кормления детенышей.В первую очередь этот прием был применен для изучения функций плотныхконтактов на сельскохозяйственных животных (коза и корова) – при уменьшениичастоты доения в течение суток или при его полном прекращении.
Накоплениесекрета в молочной железе козы в течение 36 часов приводило к достоверномуснижению трансэпителиального потенциала и увеличению концентрации лактозыв плазме крови. Более детальный анализ этих параметров свидетельствует, чтоувеличение проницаемости начинается примерно через 21 ч после началанакопления молока (Stelwagen et al., 1994)Используя перерыв в выведении молока в течение 24 часов, определилидинамику изменения лактозы в крови коров.
В течение первых двух сутокпроисходило пятикратное увеличение концентрации лактозы в плазме крови,затем в течение двух суток концентрация лактозы возвращалась к контрольнымзначениям. Накопление молока приводило к увеличению проницаемости эпителияальвеол. После первого доения, то есть снятия механического давлениянакопленного секрета, эпителий снова становился непроницаемым (Stelwagen etal., 1994b). Первоначальное увеличение проницаемости эпителия, которое авторысвязывают с нарушением структуры плотных контактов, исчезает и происходит,по-видимому, восстановление функций плотных контактов. Решение вопроса отом, что происходит с плотными контактами возможно только при исследованииизменений белков, его образующих, то есть клаудинов.Во всех опытах на козах или коровах, при использовании методанакопления секрета в полости альвеол, экспериментов, которые оценивалисостояние плотных контактов, не проводили.40Молочная железа мыши как объект для изучения механическогорастяжения альвеолы и изучения плотных контактов.
Один из подходов визучении вклада различных белков плотных контактов в реализацию их функцийзаключается в том, чтобы подбирать органы или создавать условия, при которыхклаудины проявляют свое функциональное значение. В этом плане молочнаяжелеза является удобной моделью для изучения роли клаудинов в обеспечениицелостности эпителия при механическом воздействии на него.
Особенностивскармливания потомства, а также анатомическое строение молочной железымышей обуславливают накопление секрета в полости альвеол и повышениюдавления внутри альвеолы.Анатомические особенности строения молочных желез связаны с развитиемемкостнойсистемы,котораяпредставляетсобойобъем,образуемыйсовокупностью внутренних полостей альвеол и разветвленной системой протоков,синусов и цистерн молочной железы. Коровы и козы характеризуются наличиемразветвленной системы мелких и крупных протоков, а также развитиемзначительной по объему цистерны самой железы и сосков (Грачев, Галанцев,1974) У этих животных происходит постепенное заполнение молоком протоков ицистерн молочной железы между кормлением или доением (Bruckmaier et al.,1993, 1994б).
Изучение индивидуальных профилей накопления молока в течение24 ч у коров путем введения катетера в полость соска свидетельствует, чтоцистернальный отдел начинает заполняться сразу же после доения (Stewagen etal., 1996).Относительно коз и коров известно, что в емкостных отделах железы укоров депонируется от 17 до 55% молока (Knight,Dewhurst, 1994; Pfeilstiker et al.,1996), а у коз до 27% (Bruckmaier et al., 1994b).
В результате накопления молока вемкостной системе формируется гидростатическое давление жидкости, средняявеличина которого у коров достигает 3-4 кПа (Mein et al., 1987; Willams, Mein1987; Bruckmaier et al., 1994a).У грызунов – мышей и крыс – протоки не образуют ни цистерн, ни синусов,необходимые для продвижения секрета из полости альвеол (Грачев и др., 1976).41Перерывы в кормлении детенышей у самок мышей в естественных условияхмогут достигать более двух часов (Марков, 1991). Изучение интенсивностивключения меченых аминокислот в ткань молочной железы свидетельствует оналичии конститутивной секреции в молочной железе, что обеспечиваетнепрерывное поступление секрета в полость альвеолы. Так, исследованиеинтенсивности включения S35-метионина в изолированных клетках молочнойжелезы мышей и процесса секреции белков при применении аналогов цАМФ, цГМФ и Сa–ионофора иономицина свидетельствуют о наличии конститутивнойсекреции в этих клетках (Turner et al., 1992;).
Включение H3- лейцина в тканьмолочной железы происходит минимум в течение шести часов послепрекращения кормления детенышей (Марков, 2002). Изменения веса молочнойжелезы у мышей свидетельствует также о том, что динамика накопления молокаподдерживается на постоянном уровне в течение многих часов послепрекращения кормления потомства (Кислякова и др., 1974).Тем не менее, давление в выводных протоках молочной железы мышей неповышается даже через двадцать часов после прекращения кормления детенышей(Толкунов,Марков,1997).Втожевремя,амплитудасокращениймиоэпителиальных клеток, сила сокращений которых зависит от степени ихрастяжения, в ответ на тестирующие аппликации окситоцина, через этотпромежуток времени достоверно увеличивается (Толкунов, Марков 1997).Накопление секрета и повышение гидростатического давления происходит впервую очередь в полости альвеолы молочной железы мыши.
Следовательно,можно предположить, что апикальные участки мембраны секреторного эпителияпосле прекращения кормления испытывают механическое давление со сторонысекрета, находящегося в полости альвеол. Увеличение массы секрета в полостиальвеол приводит к изменению функционального состояния секреторных имиоэпителиальных клеток. Вероятно, что эти изменения могут затрагиватьморфофункциональное взаимодействие клеток альвеол, связанное с нарушениемцелостности этой структуры в связи с механическим воздействием накопившегосясекрета.42В физиологических экспериментах, связанных с изучением деятельностисекреторных и миоэпителиальных клеток молочной железы мышей, самкуотсаживали от потомства на два (Грачев и др., 1978а); четыре (Грачев и др.,1976б), шесть (Ragueneau, 1986), более десяти часов (Higuchi et al., 1986),двадцать часов (Толкунов, Марков 1997). Исследования ультраструктурыплотных контактов эпителия альвеол молочной железы мыши, состояние альвеоли секреторных клеток, как и маркеров воспалительного процесса, не проводили.Отсутствие сведений о характере изменений функций альвеолы в период отсадкисамки от детенышей на продолжительный срок не позволяет отделитьфизиологические механизмы компенсаторных реакций от инволюционныхпроцессов, которые могут развиться при неадекватной постановке опыта.43ГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Подготовка и обработка экспериментального материалаНа всех этапах экспериментальной работы использовали самок нелинейныхбелых мышей (n=60). Животные поступали из питомника «Рапполово»(Федеральное государственное унитарное предприятие "питомник лабораторныхживотных"Рапполово").Самки,находившиесянапоследнихсрокахбеременности (17-20 дней), содержались в условиях вивария на стандартномрационе, со свободным доступом к пище и воде. Каждая самка с потомствомсодержалась в отдельной клетке, в стандартных условиях вивария. Экспериментыначинались на десятый день после родов, в период установившейся лактации.Эксперименты выполнялись в соответствии со стандартами, принятымиорганизациями по работе с лабораторными животными FELASA и RusLASA.В контрольной группе животных, тканьмолочных желез фиксировалисразу после кормления самкой детенышей.
В экспериментальной группедетенышей отсаживали от самки, прекращая тем самым выведение секрета измолочной железы, и ткань молочной железы брали через двадцать часов послеотсадки детенышей. Животных наркотизировали, проводили мастэктомию ификсировали ткань.Дляпроведенияморфометрического,гистологическогоииммуногистохимического анализа, для электронной микроскопии, определенияактивности миелопероксидазы, и для определения белков плотных контактовметодом Вестерн-блот, мастэктомии подвергались паховые (inguinal mammarygland) молочные железы самок.
В зависимости от метода обработки материала,применялась химическая фиксация или быстрая заморозка в жидком азоте.Для приготовления необходимых растворов использовались реактивыфирмы Sigma Aldrich (Германия), если не указано другого.442.2. Определение белков плотных контактов методом Вестерн-блотВестерн-блот - высокочувствительный аналитический метод, используемыйдля определения в образце специфичных белков и для сравнительногоисследования уровня этих белков. В данной работе метод Вестерн-блот былиспользован для определения белков плотных контактов в эпителии альвеолмолочной железы.Выделение мембранных белков из ткани.
Образцы ткани помещали встеклянные пробирки и добавляли 1 мл лизирующего буфера (табл. 1),содержащего детергенты для разрушения целостности структуры ткани и клеток,и ингибиторы протеаз cOmplete mini EDTA-free tablets (Roche, Германия) дляпредотвращения протеолиза белков. В буфере пробы механически растирали догомогенного состояния. Полученную суспензию перемещали в пробирки (1,5 мл)и последовательно прокачивали через шприцы с различным диаметром.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
