Диссертация (1145887), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Всепроцедуры с пробами выполнялись на льду. После центрифугирования образцовпри 200g (5 мин; 4ºС) для выделения фракции растворимых мембранных белков,к которым относятся белки плотных контактов, полученный супернатантперемещали в новые 1,5 мл пробирки и центрифугировали при 43000g (30 мин;4ºС). После центрифугирования из пробирок удаляли надосадочную жидкость и коставшейся мембранной фракции добавляли 100 мкл охлажденного лизирующегобуфера, чтобы растворить образовавшийся осадок.Определение концентрации белка. Для определения концентрации белка впробирках, содержавших фракцию мембранных белков, в отдельные ячейки 96луночного планшета наносили по 10 мкл каждой пробы и добавляли 190 мклбычьегосывороточногоальбумина(BSA)(ThermoScientific,США).Дляпостроения калибровочной кривой в отдельные лунки планшета наносили 10 мклбидистилированной воды (нулевая точка) и по 10 мкл раствора стандартногобычьего сывороточного альбумина (BSA) с концентрацией белка 0,2, 0,8 и 1,2мг/мл (Thermo Scientific, США), к которым так же добавляли 190 мкл BSA PierceProtein Assay.
В качестве контроля аутофлуоресценции использовали лунки с 10мкл лизирующего буфера и 190 мкл BSA Pierce Protein Assay. После нанесения45проб, планшет предварительно инкубировали в термостате (30 мин; 37 ºС) и затемпомещали в спектрофотометр Tecan Spectra (Tecan, Швейцария) для определенияконцентрации белка в пробах (длина волны 562 нм). На основе полученныхданных рассчитывали объем каждой пробы для проведения электрофореза вполиакриламидном геле.Электрофорез в полиакриламидном геле.
Для разделения выделеннойфракциибелковпомолекулярноймассеиспользовалсявертикальныйэлектрофорез в полиакриламидном геле с концентрацией додецилсульфатнатрия(SDS) 12,5%. Предварительно к пробам добавляли буфер Laemmli (Bio-rad,США), нагревали с помощью термошейкера (5 мин; 95ºС) и пипетировали вкарманы геля. В отдельный карман геля наносили маркер PageRuler PrestainedProtein Ladder (Bio-rad, США).
Электрофорез проводился в буфере дляэлектрофореза (табл. 1) при постоянном напряжении 100 В (120 мин; 22ºС).Электроперенос белков с геля на мембрану. На следующем этапе белки поддействием электрического тока переносились с поликриламидного геля наполивинилденфторидные (ПВДФ) мембраны (GE Healthcare, Германия). ПВДФмембраныпредварительноинкубироваливметаноле(5мин;22ºС).Электроперенос происходил при постоянном напряжении в 100 В в буфере дляэлектропереноса (табл.
1) (60 мин; 22ºС).Иммуноокрашивание белков на ПВДФ мембране. После процедурыэлектропереноса ПВДФ мембраны инкубировали в блокирующем растворе (Табл.4) (120 мин, 22ºС) для предотвращения неспецифического связывания антител.Табл. 4. Состав растворов, использованных для проведения Вестерн-блотаНазваниеСоставЛизирующий буфер10 мM Трис-HCl 7,5; 150 мM NaCl; 0,5% ТритонX-100, 0,1% SDS46Трис-HCl 7,51,5 M Трис-буффер; 37% HCl до pH до 7,5TBS10 мM Трис-HCl; 150 мM NaCl;pH 7,5,Буфер для электрофореза25 мM Трис; 190 мM глицин; 0,1% SDS; pH 8,325 мM Трис; 190 мM глицин; 0,1% SDS;Буфер для электротрансфера10% метанол; pH 8,3TBST10 мM Трис-HCl; 150 мM NaCl; 0,1% Tween 20;pH 7,5Блокирующий растворTBS; 5% сухое молокоДалее ПВДФ мембраны инкубировались в растворе первичных мышиных антителк клаудину-4 и окклюдину (1:1000; 4ºС) или растворе первичных кроличьихантител к клаудину-1, -2, -3, -5, -7 и -8 (Invitrogen, США) (1:1000; 4ºС).
Наследующем этапе ПВДФ мембраны промывали в TBST (табл. 1) (3 х 5 мин; 22ºС)и инкубировали в растворе вторичных козьих анти-мышиных или козьих антикроличьих антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (Invitrogen, США)(1:1000; 45 мин, 22ºС).Денситометрия. Для последующей визуализации белков на ПВДФмембране последовательно промывали в TBST (3 х 5 мин; 22ºС) и TBS (табл. 1) (5мин; 22ºС), после чего инкубировали в растворе Lumi-LightPLUS (RocheDiagnostics, Германия) (5 мин, 22ºС). Детекция сигнала осуществлялась наанализаторе изображений LAS-1000 (Fujifilm, Япония). Обработка изображенийвыполняласьспомощьюпрограммногообеспеченияAIDARaytest2,5(Straubenhardt, Германия).
Полученные в результате денситометрии значениявыражены в оптических единицах. Для последующей статистической обработкиданные были переведены в условные единицы. Контрольные значенияпринимались за 100%, уровень белков в опыте высчитывался относительноконтроля.472.3. Изучение гистологической структуры препаратов ткани молочнойжелезы с помощью световой микроскопииСветовая микроскопия дает возможность увидеть наличие или отсутствиеизменений в структуре ткани молочной железы, вызванных экспериментальнымвоздействием. Для изучения структуры ткани с помощью световой микроскопии,тканьнеобходимозафиксировать,приготовитьиокраситьпрепараты.Фрагменты ткани молочной железы фиксировали в забуференном 10% формалине(3 часа, 22ºС) с последующей длительной отмывкой от фиксатора сначала впроточной воде, а затем в фосфатном буфере (PBS) с Ca2+ и Mg2+.
Потом образцыпроводили через ряд спиртов возрастающей концентрации для обезвоживания изаключали в парафин по стандартной методике. Полученные с помощьюмикротома, срезы толщиной 5 мкм монтировали на предметные стекла ипроводили процедуру депарафинизации ксилолом (две смены ксилола, по 5 мин. вкаждой при комнатной температуре).
Удаляли ксилол, помещая предметныестекла поочередно в спирты нисходящей концентрации вплоть до 40%, промывстекла в дистиллированной воде, переносили в краситель. Методом, хорошовыявляющим общую структуру ткани, отдельные клеточные элементы инекоторые неклеточные структуры, является окраска срезовгематоксилин-эозином. Срезы окрашивали гематоксилином Эрлиха в течении пяти минут.Гематоксилин — основной краситель, окрашивает ядра клеток в тёмно-синийцвет, ядерный матрикс в бледно-голубой или оставляет прозрачным.
Послеокрашивания следовали промывание в дистиллированной, затем в проточнойводе, дифференцировка в 1 % солянокислом спирте, восстановление в аммиачнойводе и окончательное промывание в дистиллированной воде. Потом стеклапомещали на три минуты в водный раствор эозина. Эозин — кислый краситель,окрашивает цитоплазму и соединительные ткани в розовый цвет. Далее следовалообезвоживание срезов в спиртах восходящей концентрации (50%, 60%, 70% и96%, абсолютный спирт), просветление срезов в двух сменах ксилола изаключение в бальзам. Монтаж покровных стекол на срезах осуществлялся при48помощи Corbit-Balsam (Hecht, Германия). Оценку гистологической структурыткани проводили на световом микроскопе фирмы Leitz (Германия).2.4.
Иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов дляизучения локализации белков плотных контактовИммуногистохимическоеорашиваниеиспользуетсялокализации белков плотных контактов вдляопределенияальвеолах молочной железы.Процедура подготовки срезов для иммуногистохимиического исследованияидентична процедуре подготовки срезов для световой микроскопии.После депарафинизации, стекла со срезами кипятили в 1мМ ЭДТА рН 8.0(15 мин), после чего инкубировали в блокировочном растворе (PBS, 5% козьясыворотка, 1% БСА) (120 мин, 22ºС).
Для определения локализации белковплотных контактов использовали первичные мышиные антитела к окклюдину иклаудину-4 (1:100; 60 мин, 37°С) и первичные кроличьи антитела к клаудину-1, 2, -3, -5, -7, -8 (Invitrogen, США) (1:100; 60 мин, 37°С). После промывки стеколблокирующим раствором (3 х 5 мин; 22ºС) на срезы наносили вторичные козьианти-мышиные антитела Alexa Fluor 594 и вторичные козьи анти-кроличьиантитела Alexa Fluor 488 (Invitrogen, США) (1:500; 45 мин, 37°С). Переднанесением покровных стекол срезы инкубировали с красителем DAPI (Roche,Германия) (1:5000; 5 мин, 22°С) для визуализации клеточных ядер и послепромывали в дистиллированной воде и в 100% этаноле.Анализ полученных изображений производился с помощью лазерногосканирующего микроскопа LSM 510 META (Zeiss, Германия) и программногообеспечения LSM Image Browser (Zeiss, Германия). Окклюдин на полученныхпрепаратахимеетзеленоесвечение,клаудины-красноесвечение.Флуоресцентный краситель DAPI дает свечение синим цветом.2.5.
Исследование ткани молочной железы с помощью электронноймикроскопииФрагменты ткани молочной железы, взятые для исследования, подвергалисьобработкепоследующейсхеме:префиксацияв2,5%-омраствореглутаральдегида, на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) с хлоридом кальция (1%), в49течение 2 ч при температуре +4оС;постфиксация в 2%-номрастворечетырехокиси осмия (ОsО4) на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) в течение 2 ч притемпературе +4оС; промывка и обезвоживание в серии спиртов возрастающейконцентрации. Затем следует пропитывание заливочной средой и переход кследующим этапам:заливке в отвердевающую смолу «Эпон» и помещениюблоков в термостат для полимеризации.
Режим полимеризации проходит привозрастающей температуре 1) при температуре 35°С —24 ч; 2) 45°С — 24 ч; 3)60°С — 24 ч.Для выявления зон, оптимальных для электронно-микроскопическогоисследования, получали полутонкие срезы на ультрамикротоме Leica EM UC7.Затем срезы помещали на предметное стекло и окрашивали толуидиновым синим.Препараты смотрели под микроскопом JEM-1400, отметив область, пригоднуюдля электронно-микроскопического исследования, переходили к ультратонкимсрезам.Ультратонкие срезы готовились на ультрамикротоме Leica EM UC7.Окраска срезов проводилась уранилацетатом и цитратом свинца. Препаратысмотрели на просвечивающем электронном микроскопе JEM-1400, имеющеммаксимальное ускоряющее напряжение 120 кВ.2.6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
