Диссертация (1145887), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Концентрацияионов натрия и хлора уменьшается в секрете по сравнению с молозивом с 61 до 1523ммоль/л и с 62 до 43 ммоль/л, соответственно. Увеличивается концентрацияионов калия с 27 до 45 ммоль/л, а также лактозы с 72 до 139 ммоль/л. Авторысвязывают данные изменения с развитием структуры плотных контактов междусоседними клетками эпителия и ограничения межклеточного пути транспорта(Linzell & Peaker, 1974).Этаработазадалаопределенныйстандартвоценкеизмененияпроницаемости плотных контактов в эпителии молочной железы при изучении накрупных животных. С этого момента регистрация разности потенциалов междукровью и полостью альвеолы, изменение концентрации лактозы в плазме крови инатриявмолокерассматриваюткаксистемныепоказателиизмененияпроницаемости эпителии молочной железы.
Считают, что уменьшение разностипотенциала, повышение уровня лактозы в плазме крови, а также одновременноеповышение натрия в молоке, свидетельствует о нарушение функций плотныхконтактов в период лактации (Stelwagen et al., 1994a; 1994b; 1995; 1997; Stumpf etal., 2013). Регистрация сходных изменений в конце лактации свидетельствует обинволюции молочной железы.В дальнейшем разрабатывали другие методические приемы, позволяющиеоценить проницаемость эпителия и, косвенно, состояние плотных контактов.
Укоров, при перерыве в освобождении железы от секрета на 24 ч, установиливысокую степень корреляции между повышением лактозы и альфа-лактальбуминав плазме крови. Одновременно изменялось содержание ионного состава молока.Авторы считают, что данный параметр можно использовать для оценкинарушения функций плотных контактов (Stelwagen et al., 1997). Возможностьиспользованияэтогопараметра(альфа-лактаальбумина)подкрепленоисследованиями по изучению секреции протеинов молока в базолатеральномучастке мембраны эпителиоцитов молочной железы. Изучив состав лимфы насодержание органических компонентов молока при различных воздействиях,авторы делают вывод о том, что базолатеральная секреция органическихкомпонентов молока отсутствует. Их появление в плазме крови является24результатом парацеллюлярной диффузии из полости альвеолы при нарушенииплотных контактов (Stelwagen et al., 1998a).Оценкуфункцийплотныхконтактовможнопроводитьипопротивоположному принципу − изучая движения инъецированных веществ извыводных протоков и полости альвеол во внутреннюю среду организма.
Вчастности, в выводные протоки вводят голубой Эванс (Evans blue), а потомопределяют его наличие в лимфатических узлах молочной железы (Stelwagen etal., 1995).Стоит отметить, что вывод о том, что именно плотные контакты играютсущественную роль в обеспечении этих процессов, представляется не более чемлогическимумозаключением,таккакэкспериментов,подтверждающихизменение в структуре именно плотных контактов, проведено не было. Понятно,что для сохранения концентрационных различий в составе этих жидкостейнеобходимо предотвратить межклеточный транспорт ионов и органическихсоединений в полость альвеолы и из нее. В тоже время нельзя исключить, чтомежклеточный транспорт ионов (или органических соединений) может вноситьсвой вклад в процесс формирования секрета(Nguyen, Neville 1998; Itoh, Bissell2003).Молекулярное строение плотных контактов.
Необходимым условиемвозникновения трансэпителиального сопротивления и потенциала являетсяналичие структур, обеспечивающих изоляцию базальной и апикальной частиклеток (Cereijido et al., 1989). Существовало несколько гипотез о молекулярнойструктуре плотных контактов. Некоторые авторы предполагали, что в основеплотных контактов лежат нетрадиционные липидные структуры (Kachar, Reese,1982; Pinto da Silva, Kachar, 1982).
Однако, после открытия в лаборатории S.Tsukita трансмембранных белков (окклюдина и клаудина-1, -2) утвердилосьпредставление о том, что плотные контакты представляют собой непрерывнуюсеть интегральных мембранныхбелков, взаимодействующихчерез своивнеклеточные петли (Furuse et al. 1993; 1998; Tsukita, Furuse, 1999). Плотныеконтакты состоят из интегральных белков плазматической мембраны клеток и25связанных с ними белков цитоплазмы (Günzel, Fromm, 2012). В состав плотныхконтактов входят различные молекулярные компоненты: трансмембранный белококклюдин (Furuse et al., 1993), семейство белка клаудина (Furuse et al., 1998),белки адгезии − JAM (Martìn-Padura et al., 1998) и трансмембранный белоктрицеллюлин (Ikenouchi et al., 2005), а также внутриклеточные белки, связанные сними (Tsukitaet al., 2001).
Функции данных белков плотных контактовзаключаются в соединении клеток между собой, обеспечении селективногобарьера для транспорта веществ и ионов (Gonsales-Mariscal et al., 2003). Былопоказано, что плотные контакты активируют различные сигнальные белки,контролирующиепролиферацию,дифференциациюиполярностьклеток,действуя, таким образом, как мультифункциональный комплекс (Matter et al.,2005; Tsukita et al., 2001). Современные исследования направлены на изучениевклада отдельных белков плотных контактов или их кластеров в различныефункции плотных контактов (Krug et al. 2014; Markov et al, 2015).Важное значение в составе апикального комплекса играет семействоклаудинов. Клаудины – трансмембранные высоко консервативные белки – имеютчетыре трансмембранных домена и две гидрофобных внеклеточных петли,которые, как полагают, опосредуют клеточную адгезию и определяют свойствапарацеллюлярной проницаемости клеточных монослоев (Turksen, Troy, 2004).Электронная микроскопия замораживания-скалывания показывает, что нитиплотных контактов образуют непрерывную сеть внутримембранных нитей,состоящих из частиц, которые содержат один или несколько клаудинов (Sasaki etal.
2003). Состав клаудинов определяет характер сети нитей плотных контактов ипарацеллюлярную проницаемость плотных контактов (Tsukita, Furuse 2000a). Вразных тканях и органах распределение этих белков сильно различается.На настоящий момент известно более двадцати членов семейства клаудина.Клаудины можно разделить на две группы по выполняемым ими функциям. Однагруппа белков (клаудины-1,-3,-4,-5, -8) вносит вклад в барьерные свойстваэпителия, увеличивая непроницаемость плотных контактов (Furuse et al., 2002;Milatz et al., 2008; Zeissig et al., 2007; Amasheh et al., 2009), другая (клаудины-2, -267, -12, -15 и -16) может формировать селективные ионные поры (Amasheh et al.,2002; Fujita et al., 2008; Colegio et al. 2002; Alexandre et al., 2005; Blanchard et al.,2001).
Избирательные к небольшим катионам поры, образуются с участиемклаудина-2 (Amasheh et al., 2002, Furuse et al., 2002), а клаудин-16 (парацеллин-1)обеспечивает межклеточную проницаемость для Са2+ и Mg2+ (Simon et al., 1999). ВСа2+- абсорбции участвует и клаудин-12 (Fujita et al., 2008).Изучение плотных контактов в молочной железе. Важную роль вотделении полости альвеолы от межклеточного пространства, т.е. созданиитканевого барьера и в объединении секреторных клеток в составе альвеолывыполняют плотные контакты, расположенные в апикальной области железистогоэпителия (Pitelka et al. 1973; Ngyuen, Neville, 1998).Исследование молекулярного состава плотных контактов проводят наразличных клеточных линиях молочной железы, а также в ткани молочнойжелезы различных видов животных. Общепринятым подходом для достовернойидентификацииэтихГибридизационныйбелковявляетсяанализДНКприменениеразличных(ДНК-гибридизация)методов.позволяетпроанализировать экспрессию генов.
Определение транскриптов клаудиновпроводят с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Наличие в клеткахопределенногоклаудинаосуществляютметодомВестерн-блота.Иммуногистохимия позволяет визуализировать белок в структуре клетки:световаяиммуногистохимия дает общую картину его распределения, но не позволяетуточнить его локализацию в отдельных клеточных структурах. Лазернаясканирующая микроскопия дает локализацию клаудинов на ультраструктурномуровне, то есть позволяет идентифицировать их в области плотных контактов.Молекулярный спектр клаудинов в плотных контактах линий клетокэпителия молочной железы.
В линиях клеток молочной железы обнаруженыразнообразные клаудины (Табл. 2). В мышиной линии клеток молочной железыHC11 методом Вестерн-блот была выявлена экспрессия таких клаудинов как-1,-3,4,-5,-7,-8,-15 и -16. Клаудины -2, -10, -14 и -18 в HC11 клетках обнаружены небыли (Reiteret al., 2006). Гибридизационный анализ ДНК и Вестерн-блот27показывает, что различные клоны линии клеток HMEC (иммортализованных илис конечной продолжительностью жизни (finite lifespan)) проявляют различнуюспособность к экспресии клаудина-7. В некоторых из них клаудин-7 отсутствовал(Kominsky et al., 2003).Таблица 2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
