Диссертация (1145887), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Общим для всех клаудинов является то, что ониопределяются как белки ко-локализованные с белком-маркером плотныхконтактов в апикальной области эпителия.Приокрашиваниисрезовтканинаокклюдиниклаудин-1,иммунофлюоресценция для окклюдина визуализируется как ряд точек идугообразныхкривыхвапикальнойчастиэпителиоцитов.Свечениев77контрольной и опытной группе сходно по интенсивности. Яркость сигнала дляклаудина-1 больше в опытной группе животных.
Особенно заметно увеличениеклаудина-1 на имиджах с объединением изображения. Интенсивность желтогосигнала превышает таковую на контрольных препаратах (Рис. 12).Окклюдин, при окрашивании срезов совместно с клаудином-3, также даетчеткий сигнал, позволяющий идентифицировать относительно его расположения,локализацию других белков плотных контактов. Насыщенность сигнала дляклаудина-3 в контроле меньше, чем на препаратах в опыте.
При объединенииизображений, желтый сигнал на препаратах опытной группы, с отсадкойдетенышей на 20 часов, существенно интенсивнее и обнаруживается в большемколичестве альвеол (Рис. 13).Интенсивность сигнала для окклюдина, при окрашивании совместно склаудином-16, не различалась в контрольной и опытной группах. Свечениеокклюдина, также в виде отдельных точек или (и) гемициклических линий, есть вапикальной зоне клеточной мембраны. Интенсивность сигнала для клаудина-16на контрольных препаратах существенно выше, чемна срезахопытныхпрепаратов.
При совмещении изображений, общая площадь локализации иинтенсивность желтого свечения на препаратах из ткани контрольных животных,во много раз больше, чем на препаратах опытной группы (Рис.14).Результаты иммуногистохимии свидетельствуют о локализации клаудинов взоне плотного контакта. Данные по Вестерн-блоту хорошо коррелируют сданными по иммуногистохимии, подтверждая изменения в уровне клаудинов примеханическом растяжении альвеолы.78Рис. 10. Вестерн-блот белков плотных контактов в ткани молочной железы мышисlaudin – обозначение белков семейства клаудина, occludin – обозначение белкаокклюдина, beta-actin (бета-актин) – внутренний контроль79Рис.
11. Сравнение интенсивности сигналов белков плотных контактов в тканимолочной железы мышей методом денситометрииИнтенсивность сигнала в контроле принимали за 100%.Нижняя панель – примеры блотов клаудинов в ткани молочной железы мыши**р<0,01; ***р<0,001,ocln – обозначение белков семейства клаудина, cldn – обозначение белкаокклюдина80Рис.
12. Иммунофлюоресценция клаудина-1 в альвеоле молочной железы мышиа – локализация окклюдина, б – локализация клаудина-1 в контроле и послеотсадки на 20 ч; в – результат совмещения имиджей в контроле и после отсадкина 20 ч. Стрелки на имиджах показывает расположение белков плотныхконтактов: зеленый цвет – окклюдин, красный – клаудин, желтый - колокализацияклаудина и окклюдина. Голубое окрашивание – ядра эпителиальных клеток.81Рис. 13.
Иммунофлюоресценция клаудина-3 в альвеоле молочной железы мышиа – локализация окклюдина, б – локализация клаудина-3 в контроле и послеотсадки на 20 ч; в – результат совмещения имиджей в контроле и после отсадкина 20 ч. Стрелки на имиджах показывает расположение белков плотныхконтактов: зеленый цвет – окклюдин, красный – клаудин, желтый - колокализацияклаудина и окклюдина.
Голубое окрашивание – ядра эпителиальных клеток82Рис. 14. Иммунофлюоресценция клаудина-16 в альвеоле молочной железы мышиа – локализация окклюдина, б – локализация клаудина-16 в контроле и послеотсадки на 20 ч; в – результат совмещения имиджей в контроле и после отсадкина 20 ч.Стрелки на имиджах показывает расположение белков плотныхконтактов: зеленый цвет – окклюдин, красный – клаудин, желтый - колокализацияклаудина и окклюдина. Голубое окрашивание – ядра эпителиальных клеток835.3. Изменение длины плотных контактов эпителиоцитов молочнойжелезы при длительной отсадке детенышейВ первую очередь стоит отметить, что перерыв в кормлении и аккумуляциясекрета в полости альвеолы не приводит к разрушению плотных контактов,целостность эпителиального барьера остается не нарушенной.Болеетого,накоплениесекрета,приводящееквозникновениюмеханического давления на апикальную мембрану эпителия, вызывает изменениедлины плотных контактов. В контрольной группе протяженность этой структурыбыла равна 2,1 ± 0,1 мкм.
В опытной группе длина плотных контактовувеличилась в два раза по сравнению с контролем и была равна 4,2 ± 0,1 мкм(p<0,01 n= 12; U-критерий Манна - Уитни) .На электронограммах эпителия альвеол молочной железы видно, чтоплотные контакты контрольной и опытной групп отличаются друг от друга нетолько по длине, но и по геометрии. Плотные контакты в контрольной группепрямые, плотные контакты в опытной группе вытянуты и, в большинстве случаев,имеют изогнутую форму, их протяженность больше протяженности плотныхконтактов контрольной группы (Рис.
15.).Таким образом, механическое давление, которое действует на апикальнуюсторону секреторного эпителия альвеол молочной железы, приводит к изменениюдлины плотных контактов.84Рис. 15.. Изменение длины и формы плотных контактов в эпителии альвеолмолочной железы мышиЭлектронные фотографии альвеол : А − контрольной, Б –экспериментальнойгруппы животных.ПА – полость альвеолы, ПК – плотные контакты,[a* <—> b*] – линия длины плотного контакта. Линия расположена рядом иповторяет геометрию плотного контакта855.4. Обсуждение полученных результатовУвеличение давления в системе протоков и каналов является необходимымусловием выведения секрета из молочной железы (Williams, Mein, 1987).Известно, что увеличение продолжительности перерыва в кормлении или доениисопровождается накоплением секрета в протоковой системе иповышениемдавления в молочной железе (Bruckmaier et al., 1994).
Однако, до настоящеговремени изменение барьерных свойств секреторного эпителия в условиях,приводящих к накоплению секрета в полости альвеол, на молекулярном уровне непроводили.Обнаружено, что перерыв в кормлении детенышей, как методическоеусловие аккумулирования секрета в полости альвеол, приводит к изменениюуровня различных клаудинов в плотных контактах секреторного эпителия альвеолмолочной железы мыши. Вестерн блот и иммуноцитохимия показали увеличениеуровня клаудина-1 и -3, уменьшающих проницаемость эпителия, и снижениеклаудина-2 и -16, которые увеличивают проницаемость эпителия.Анализ возможного влияния компонентов молока в полости альвеолы наизменение уровня клаудинов в эпителии молочной железы мыши.
Однако,проведениеисследованияinvivoтребуетанализадругихвозможныхрегулирующих факторов, которые также могут влиять на данный процесс. Быловысказано предположение, что накопление секрета в полости альвеолы вызываетактивациюаутокриннойрегуляциисекрециимолока,вкоторой,предположительно, участвуют компоненты секрета (Wilde, Peaker, 1990).Исследования влияния составных частей молока на проницаемостьсекреторного эпителия альвеол или линий клеток молочной железы отсутствуют.Тестирование этих соединений, в основном, проведено на эпителии кишкиразличных видов животных или культуре клеток энтероцитов.Одним из соединений, которое стоит проанализировать в этом плане,являются простагландины, так как, их концентрация в молоке возрастает в ходелактации (Марков и др., 2006). Использование агонистов простагландина86уменьшает трансэпителиальное сопротивление и увеличивает проницаемость дляD-маннитола в культуре клеток Сасо-2.
Снижение барьерных свойств в этихклетках при действии этих соединений коррелировало с перераспределениемокклюдина и ZO-1 (Rodríguez-Lagunas et al., 2010). Эти данные свидетельствуют отом, что простагландины могут изменять парацеллюлярный транспорт, возможно,оказывая влияние на плотные контакты. Однако, простагландины снижаютбарьерныесвойстваэпителиальногомонослоя,тоестьоказываютпротивоположный эффект, по сравнению с теми данными, которые получены впроведенном исследовании.В данном контексте, то есть влияния отдельных составных частей молока набарьерные свойства эпителия, интересны также результаты о тех его соединениях,для которых показано изменение барьерной функции кишки, например, глутамат,лаурат и лактоферрин.L-глутамат является основной аминокислотой в молоке и молочных диетахдлямлекопитающих,включаячеловека.повышаетL-глутаматтрансэпителиальное сопротивление и снижает парацеллюлярный транспорт вклетках IPEC-1 и увеличивает уровень окклюдина, и, что важно для обсужденияполученных данных, клаудина-3 (Jiao et al., 2015).
Одно их производныхлактоферрина, состоящее из двадцати аминокислот в N-конце лактоферринаантимикробный пептид (LFP-20) свиньи, увеличивает трансэпителиальноесопротивление, снижает парацеллюлярную проницаемость, а также повышаетуровень клаудина-1 в линии клеток кишки свиньи (IPEC-1) (Zong et al., 2016).Лауриновая кислота увеличивает парацеллюлярный транспорт для органическихмолекул, снижая уровень клаудина-5 в клетках линии 29/B6 (Dittmann et al., 2014).Таким образом, отдельные соединения молока вызывают противоположныеизменения барьерных свойств эпителия кишки и уровня клаудинов.Стоитзаметить,чтомолокопредставляетсобойсложнуюмногокомпонентную жидкость, в которой свойства ее отдельных соединениймогутсущественноменятьсяврезультатевзаимодействиясдругимисоединениями. Использование молока, а также термически обработанного87молока, на кишечный эпителий свиньи не выявил изменения в парацеллюлярнойпроницаемости для флуоресцеина натрия.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
