Диссертация (1145883), страница 21
Текст из файла (страница 21)
В геноме этого штамма содержатся 4 нонсенс-мутации: ade1-14 (UGA),his7-1 (UAA), lys9-A21 (UAA) и trp1-289 (UAG) — которые позволяют следить занонсенс-супрессией по отношению к каждому из трёх стоп-кодонов. Ранее показано, что делеция SFP1 в штамме 1Б-Д1606 приводит к выраженной супрессиивсех нонсенс-мутаций (Радченко, 2014). Мы показали, что введение центромерной плазмиды с SFP1 лишь в разной степени компенсирует супрессию каждой112из маркерных нонсенс-мутаций, однако ни в одном случае клоны с компенсирующей плазмидой не росли с той же эффективностью, что и клоны с интактнымгеном SFP1 в геноме (рис. 3.28), что сходно с данными, полученными ранее дляштамма 25-25-2В-П3982 (Rogoza et al., 2010). Мы аналогичным образом проанализировали кариотип штамма sfp1Δ-1Б-Д1606 и выявили, что этот штаммтакже является эуплоидом (приложение Д, Ф). Эти данные подтверждают гипотезу о том, что при получении делеции SFP1 или при культивировании такихштаммов отбираются дополнительные супрессорные мутации, причём такие мутации представляют собой не дупликации хромосом и не крупные делеции илидупликации, поскольку такие события были бы зарегистрированы при анализекариотипа.SC-UraSC-UraAdeSC-UraHisSC-UraLysSC-UraTrp1Б-Д1606, контрольконтрольsfp1Δ1Б-Д1606SFP1Рисунок 3.28 — Введение центромерной плазмиды с SFP1 не полностью компенсирует нонсенс-супрессию, вызванную делецией SFP1, в штамме 1Б-Д1606.
Показаны результаты анализа фенотипа методом отпечатков на 6-й день инкубации. Контроль, pRS316; SFP1, pMT3193(pRS316-SFP1).3.6. Поиск связи между обработкой GuHCl и изменением кариотипаКак показано ранее, пятикратное пассирование клонов Isp+ штамма25-2В-П3982 на среде, содержащей GuHCl в концентрации 5 мМ, приводит кизменению фенотипа на Isp– (Волков и др., 1997) c частотой около 97% (Волков,2000; Аксенова, 2006). Это изменение фенотипа внешне сходно с излечиванием дрожжевых прионов, однако не связано с активностью Hsp104 (Volkov etal., 2002) — и, следовательно, опосредовано иным механизмом.
Этот механизмпредположительно связан с активностью белка Hal3 (Аксенова, 2006), однакополностью не расшифрован.113Мы повторили эксперимент по пассированию клонов фенотипа Isp+ насреде с GuHCl по описанной ранее схеме (Волков, 2000; Аксенова, 2006): 32субклона изучаемого изолята пятикратно пересевали на среду, содержащую 5мМ GuHCl, после чего субклонировали, отбирали по 4 субклона и анализировали их фенотип.
Эти эксперименты провели для использованного в анализекариотипа изолята 25-2В-П3982 и изолята p1 штамма 25-25-2В-П3982. В случае25-2В-П3982 число клонов Lys+ составило 6 штук (около 5%); 2 из них (около 1,5%) обладали фенотипом Lys+ His+ . В случае p1 зарегистировали 17 клоновLys+ (около 13%), 16 из которых (12,5%) обладали фенотипом Lys+ His+ .
Эти данные принципиально отличаются от полученных ранее (Волков, 2000; Аксенова,2006), что заставляет предположить, что наши и более ранние экспериментыбыли проведены на разном материале.Ранее было показано, что клоны Isp+ более чувствительны к наличиюв среде GuHCl, чем клоны Isp– , причём разница в чувствительности заметнапри выращивании на твёрдой среде YEPD, содержащей не менее 5 мМ GuHCl(Volkov et al., 2002; Аксенова, 2006).
Мы воспроизвели этот результат (рис. 3.29,первая и третья строки), а также показали, что потомки клонов Isp+ после пятикратного пассирования на среде с GuHCl становятся более устойчивыми кGuHCl, чем контрольные клоны, пассированные на среде YEPD, однако хужерастут на обычной среде YEPD и на среде СПГ (рис. 3.29, первая и вторая строки). Некоторые из этих клонов приобретают фенотип Lys+ . Полученные данныепозволяют предположить, что изменение фенотипа клонов Isp+ на Isp– на среде с GuHCl хотя бы частично объясняется отбором дисомиков по хромосомеII, более устойчивых к этому веществу. Для изолятов p1 и p3 получили схожиерезультаты.114Isp+, контрольYEPD-Lys, 12 д.Isp+, GuHClIsp–, контрольIsp–, GuHClIsp+, контрольIsp+, GuHClYEPD + 5 mM GuHClСПГIsp–, контрольIsp–, GuHClРисунок 3.29 — При пассировании клонов Isp+ на среде с GuHCl происходит отбор устойчивых к GuHCl клонов, часть из которых приобретает фенотип Isp– .
Показаны потомкиизолятов p1 (Isp+ ) и m1 (Isp– ) после пятикратного пассирования на среде YEPD (контроль) илина среде YEPD, содержащей GuHCl в концентрации 5 мМ на 6-й (все среды, кроме -Lys) или12-й (-Lys) день инкубации.Следует отметить, что потомки клонов Isp+ после пассирования на среде с GuHCl отличаются меньшей дыхательной компетентностью, чем потомкиIsp– , выращенные на обычной среде (рис.
3.29, вторая и третья строки). Такаясниженная способность к росту на среде СПГ потомков клонов Isp+ может объясняться тем, что мы наблюдаем смесь способных и не способных к дыханиюклонов. Мы проверили это предположение, проанализировав фенотип 48 независимых колоний Lys+ His+ , отобранных на среде без лизина, и подтвердили его:около половины (23 колонии) оказались неспособны к росту на среде СПГ.
Поскольку ранее мы исследовали кариотип только способных к дыханию изолятов,полученные данные вызывают вопрос о том, не может ли дыхательная некомпетентность являться ещё одной причиной, приводящей к супрессии.Это предположение можно проверить, сравнив копийность хромосомы II вклонах Lys+ His+ , способных и не способных к росту на СПГ, с исходным изолятом. Для косвенной оценки копийности хромосомы II мы воспользовалисьоценкой активности конститутивной кислой фосфатазы (КФ). Этот фермент удрожжей кодируется геном PHO3, расположенным на хромосоме II.
На первомэтапе мы проверили, приводит ли разница в копийности гена PHO3 к пропорциональной разнице в активности кислой фосфатазы. Действительно, в парахизолятов p1/m1 и p3/m2 мы наблюдали статистически значимую разницу в активности КФ, однако следует отметить, что в случае p3 наблюдали более высо-115кую активность КФ, чем в случае p1 (рис. 3.30А). Возможно, на этот параметроказывают влияние гены хромосомы IX или другие не учтённые особенностигенотипа.
Тем не менее, полученные данные показывают, что активность КФможно применять для оценки копийности хромосом II.****0,35***OD415/OD6000,300,250,200,15p1 (Isp+, eu)m1 (Isp–, +II)p3 (Isp+, +IX?)m2 (Isp–, +II,IX)ИзолятРисунок 3.30 — Активность кислой фосфатазы может служить показателем копийностихромосомы II. На оси ординат отражена удельная активность КФ (отношение поглощения лизата клеток при длине волны 450 нм к поглощению исходной суспензии при длине волны 600 нм);каждая точка — отдельный клон. В скобках указаны номера изолятов и их кариотип; + обозначаетприсутствие дополнительной хромосомы. eu — эуплоид * — < 0,05, ** — < 0,01 (попарныйкритерий Манна-Уитни с поправкой Холма на множественные сравнения).Чтобы определить, дуплицирована ли хромосома II в изолятах, отобранныхсо среды без лизина и не способных к дыханию, мы сравнили уровень активности КФ у потомков 10 колоний, отобранных на среде без лизина в потомствеизолята p3, пассированного на среде с GuHCl.
Мы выяснили, что в клонах, неспособных к росту на среде с глицерином (Ypg– ), уровень активности КФ повышен (рис. 3.31). Вероятно, фенотип таких клонов также объясняется дупликацией хромосомы II.116*****OD415/OD6000,450,400,350,300,250,20p3 (Isp+)Isp–Ypg+Isp–Ypg–потомки p3m2 (Isp–)Рисунок 3.31 — Активность кислой фосфатазы повышена в клонах фенотипа Isp– вне зависимости от их дыхательной компетентности.
На оси ординат отражена удельная активностьКФ (отношение поглощения лизата клеток при длине волны 450 нм к поглощению исходнойсуспензии при длине волны 600 нм); каждая точка — отдельный клон указанного изолята. * — < 0,05, ** — < 0,01, *** — < 0,001 (попарный критерий Манна-Уитни с поправкой Холмана множественные сравнения).3.7.
Анализ отдельных генов, изменение числа копий которых можетобъяснять различие фенотипов Isp+ и Isp–Наши данные показывают, что клоны Isp– отличаются от клонов Isp+ наличием дополнительной хромосомы II. На этой хромосоме расположены более450 ORF и 13 генов тРНК (данные Saccharomyces genome database на август2016 г.). Не менее чем для 6 белок-кодирующих генов хромосомы II показанасвязь с регуляцией эффективности нонсенс-супрессии (табл.
3.11). Кроме того, на этой хромосоме присутствуют гены tQ(UUG)B и tC(GCA)B, кодирующиетРНК, которые могут являться естественными супрессорными (см. раздел 1.3.2)по отношению к his7-1 (UAA) и lys2-87 (UGA).117Таблица 3.11 — Белок-кодирующие гены хромосомы II, имеющие отношение к регуляцииэффективности терминации трансляции или использованной системе детекциинонсенс-супрессии.Названиегена илиаллелиTEF2Изменение Информация о функцииСвязь сэкспрессии внонсенс–клонах Ispсупрессией1,1Кодирует фактор элонгации трансляции.↑Делеция приводит к антисупрессии, асверхэкспрессия обладает аллосупрессорным проявлением (см.
раздел 1.3.5).OLA11,4 *Кодирует АТФазу. Делеция приводит↓к нонсенс-супрессии (Samanfar et al.,2014).sup45-400 1,7 ***В гене SUP45 известны супрессорные↑↓и антисупрессорные мутации; sup45-400необходима для проявления фенотипаIsp+ (см. 1.3.4).EFM21,5 **Кодирует S-аденозил-зависимую метил↓трансферазу; делеция приводит к нонсенс-супрессии (Dzialo et al., 2014)KTI111,5Участвует в модификации тРНК и eEF2,↑взаимодействует с комплексом Elongator;делеция и мутации приводят к антисупрессии (Bär et al., 2008).RPS9B1,1Кодирует белок малой субъединицы ри↓босомы.
Известна супрессорная мутация(Vincent, Liebman, 1992).his7-11,6 **Кодирует многофункциональный фермаркермент, в том числе осуществляющий пятую и шестую реакцию пути биосинтезагистидина (Kuenzler et al., 1993).lys2-871,4 **Кодирует альфа-аминоадипатредуктазу,маркеручаствующую в биосинтезе лизина(Sinha, Bhattacharjee, 1971).Указано изменение экспрессии по результатам транскриптомного анализа.* — < 0,05, ** — < 0,01, *** — < 0,001 (модифицированный t-критерий).Направление стрелки характеризует связь гена с нонсенс-супрессией: направленная вверх стрелка указывает на существование данных об увеличении эффективности супрессии при сверхэкспрессии гена или о снижении эффективности супрессии в случае мутаций, а направленная внизстрелка — на обратную ситуацию.118Мы более подробно изучили систему, обеспечивающую супрессию his7-1,а также гены SUP45, TEF2 и KTI11, для которых показана положительная связьмежду копийностью и эффективностью нонсенс-супрессии (см.
табл. 3.11).3.7.1. Введение дополнительной копии his7-1 улучшает рост клонов Isp+ насреде без гистидинаДля проверки возможного влияния дозы гена his7-1 на эффективность нонсенс-супрессии мы сконструировали центромерную плазмиду на основе вектораpRS316. При её получении была отобрана дополнительная мутация his7-6, приводящая к замене L316P в His7p, однако данных о важности этой позиции дляактивности фермента нет. Мы обнаружили, что введение дополнительной копииhis7-1,6 приводит к усилению роста клонов Isp+ на среде без гистидина, однаконе обеспечивает уровень роста, характерный для клонов Isp– (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
