Диссертация (1145883), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Таким образом, необходимо было охарактеризовать кариотип большего числа независимо полученных клонов Isp+ и107Isp– и выяснить, существует ли корреляция между числом копий хромосом II иIX и фенотипом Isp+ / Isp– .Для проверки этого предположения изолят p3 пятикратно пассировали насреде, содержащей GuHCl, после чего отбирали супрессорные клоны в митотическом потомстве. Этот эксперимент повторяли дважды (клоны m4 и m6 отобраны в первом раунде, m7, m8, m9, m11 — во втором; см.
рис. 3.25). Изолятm2 трансформировали мультикопийной плазмидой, содержащей ген SFP1 илиSWI1-YFP, после чего отбирали клоны, потерявшие плазмиду, но сохранившиенесупрессорный фенотип (Isp+ ). Кроме того, изолят m2 пассировали на полной среде и отбирали клоны, спонтанно приобретшие фенотип Isp+ . Наконец,в анализ включили клоны наиболее ранних сохранённых в коллекции изолятов25-25-2В-П3982, которые мы обозначили p1 (Isp+ ) и m1 (Isp– ), и клоны предковых по отношению к 25-25-2В-П3982 штаммов 25-2В-П3982 фенотипа Isp+(клонов фенотипа Isp– не сохранилось) и 2В-П3982 [PSI + ] и [psi– ] (изолятов2В-П3982 без приона [PSI + ] не сохранилось, поэтому клон [psi– ] был получениз клона [PSI + ] с помощью трёхкратного пассирования на среде YEPD с 4 мМGuHCl).Наконец, из исходных изолятов и полученных клонов выделяли ДНК (фенотип дополнительно проверяли в момент сбора клеточной массы), которую использовали для анализа копийности участков генома с помощью гибридизациис ДНК-микрочипом.
Данные обрабатывали с помощью CGH-Miner (см. раздел2.7.4 и прил. Д). Если копийность материала была статистически значимо вышеожидаемой на протяжении более чем 90% длины хромосомы, делали вывод одупликации хромосомы. Общая схема происхождения использованных клонов иполученные результаты представлены на рисунке 3.25.108eu Смена типаспаривания25-*WT↑↑ SUP3525eu[PSI+]-*[psi–]-*+Ieup1p2GuHClGuHCl+II+II, IXm1m2+II, IX+II, IX+II, IX+IX (WGS)или +XIV (aCGH)m4m6GuHClm7m9m11p3eum8+II, IX eup10p12+II, IX+II, IXp11p13↑↑ SFP1eueu+IX↑↑ SWI1p14+IXp4Рисунок 3.25 — Схема, иллюстрирующая происхождение исследованных изолятов и результаты анализа их кариотипа. Голубой цвет фона соответствует изолятам фенотипа Isp– , фиолетовый – фенотипа Isp+ , белый – иного фенотипа. Серым контуром отмечены не сохранившиесядо настоящего времени штаммы.
WGS — данные полногеномного секвенирования, aCGH — данные гибридизации с микрочипом. * — 2В-П3982. ↑↑SUP35, ↑↑SFP1, ↑↑SWI1 — сверхэкспрессияSUP35, SFP1 или SWI1-YFP соответственно с последующей потерей плазмиды. Красным шрифтом обозначен кариотип; + обозначает присутствие дополнительной хромосомы; eu — эуплоид.Таблица 3.10 — Наличиедополнительной хромосомы IIкоррелирует с фенотипом Isp– .Полученные данные показывают, что переход между фенотипами Isp+ и Isp– в обоих направлениях всегда сопровождается изменениемКопийностьФенотип:хромосомы II:Isp+ Isp–180при отборе изолята m2 и далее наследоваться>108его потомками.
Следует отметить, что в боль-копийности хромосомы II (табл. 3.10). Дополнительная копия хромосомы IX могла возникнутьшинстве случаев после сверхэкспрессии SFP1отбирались клоны с эуплоидным набором хромосом, т. е. дополнительная копияхромосомы IX также терялась, однако мы не обнаружили разницы в фенотипеклонов Isp+ с эуплоидным набором хромосом и с дополнительной хромосомой109IX (данные не показаны).
Изоляты m1 и m2 отличались по эффективности роста на среде без гистидина: в случае m2 и других изолятов, содержащих дополнительную копию хромосомы IX, рост был выражен значительно сильнее,чем в случае m1, а фенотип клонов Isp+ разного кариотипа не отличался (см.ниже). Приобретение дополнительной хромосомы XIV клоном изолята p3, использованным для гибридизации с микрочипом, вероятно, произошло уже послеотбора изолятов m4–m11 и не отразилось на фенотипе (данные не показаны).Интересно отметить, что хотя наиболее близкий к исходному штамму 2В-П3982клон, обозначенный на рисунке 3.25 [PSI + ], является эуплоидом, при излечивании [PSI + ] был отобран клон с дополнительной хромосомой I.
Эти данные такжесвидетельствуют о нестабильности генома исследуемых штаммов.Кроме того, кариотип одного клона фенотипа Isp+ (p4) и одного клона фенотипа Isp– (m1) проанализировали с помощью электрофореза в пульсирующемполе (рис. 3.26). Точности этого метода недостаточно, чтобы делать уверенныевыводы о копийности хромосом, однако отсутствие разницы в длине хромосоммежду изолятами p4 и m1 является дополнительным подтверждением того, чтомы имеем дело с дупликацией целой хромосомы, а не сегментными дупликациями или транслокацией материала хромосомы II на другую хромосому.
Крометого, следует отметить, что хромосома V штамма 25-25-2В-П3982 существеннодлиннее, чем у предкового штамма. Интересно, что в обоих случаях эта хромосома длиннее, чем у штамма S288C (рис. 3.26) и штамма PSL2 (штамм, родственный W303; данные не показаны). Анализ данных полногеномного секвенирования в сравнении с геномом S288C и данных сравнительной гибридизациигеномной ДНК с геномной ДНК PSL2 (приложение Д) не выявил дупликацийдостаточно большого размера (разница длин хромосом VIII и XI в геноме S288Cсоставляет более 100 т.
п. н.), которые могли бы объяснять полученные данные.Основные отличия между геномами наблюдаются в теломерных участках. Можно предположить, что дополнительный генетический материал отсутствует в геномах S288C и W303. Остаётся неизвестным, связано ли появление этой хромосомной перестройки с единственным направленным изменением генома штамма25-2В-П3982 при получении 25-25-2В-П3982, изменением типа спаривания.110Isp+ (p4)Isp– (m1)25-2В-П3982S288CXII IVVII, XV XVI XIII II XIV X XIV VIIIIXIIIVIIРисунок 3.26 — Данные, полученные методом электрофореза в пульсирующем поле, подтверждают дупликацию всей хромосомы II в изоляте m1 и показывают изменение длиныхромосомы V в штамме 25-25-2В-П3982 по сравнению со штаммом 25-2В-П3982. Геномная ДНК S288C использована в качестве стандарта. Стрелка показывает основное направлениемиграции молекул.3.5.
Поиск связи между геном SFP1 и фенотипом Isp+Ранее показано, что при сверхэкспрессии гена SFP1 в клонах Isp– трансформанты не только приобретают фенотип His– Lys– , но и в большинстве случаевсохраняют его после окончания сверхэкспрессии SFP1 (Rogoza et al., 2010). Мыпоказали, что в клонах, изменивших фенотип после временной сверхэкспрессииSFP1, действительно пропадает дополнительная хромосома II, а также (в большинстве случаев) дополнительная хромосома IX (рис. 3.25).
Вероятно, именноизменение копийности хромосомы II связано с изменением фенотипа.Остаётся непонятным, почему при сверхэкспрессии SFP1 увеличиваетсячастота потери лишних хромосом по сравнению с контрольными условиями(трансформация пустым вектором). Поскольку сверхэкспрессия SFP1 снижает размер колоний и скорость роста трансформантов (см. выше), и, вероятно,является стрессорным фактором, можно предположить, что клоны Isp+ болееустойчивы к этому воздействию.
Мы проверили это предположение, сравниврост трансформантов клонов Isp+ и Isp– мультикопийной плазмидой с SFP1, ивыяснили, что клоны Isp+ даже более чувствительны к сверхэкспрессии SFP1,чем клоны Isp– (рис. 3.27). Таким образом, появление клонов Isp+ в потомстветрансформантов Isp– со сверхэкспрессией SFP1 нельзя объяснить отбором более быстро растущих клонов Isp+ , а видимое снижение эффективности нонсенссупрессии при сверхэкспрессии SFP1 объясняется не изменением кариотипа.111Вероятно, повышенная частота потери лишней хромосомы при сверхэкспрессииSFP1 объясняется специфическим воздействием сверхпродукции Sfp1 на клетку,возможно, опосредованным влиянием Sfp1p на транскрипцию генов, связанныхс расхождением хромосом.SC, 3 д.SC-UraSC-UraLysIsp+, контрольIsp–, контрольIsp+, ↑↑ SFP1Isp–, ↑↑ SFP1Рисунок 3.27 — Сверхэкспрессия SFP1 ингибирует рост клонов Isp+ в большей степени, чемклонов Isp– .
Показан пример фенотипического анализа трансформантов изолята p1 (Isp+ ) илиm1 (Isp– ) на 6-й или 3-й (указано) день инкубации. Контроль, pRS426; ↑↑SFP1, pRS426-SFP1.Ранее показано также, что инактивация гена SFP1 приводит к появлениюнонсенс-супрессорного фенотипа в штамме Isp+ , а при введении центромернойплазмиды с геном SFP1 супрессия his7-1 и lys2-87 сохраняется. Мы проанализировали кариотип штамма с делецией SFP1, полученного на основе клона Isp+ ,с помощью гибридизации с ДНК-микрочипом, и выявили, что этот штамм является эуплоидом (приложение Д, X).
Эти данные согласуются с результатамианализа транскриптома, однако оставляют открытым вопрос о том, чем вызваннонсенс-супрессорный фенотип клонов с делецией SFP1 при наличии компенсирующей плазмиды с SFP1. Можно предположить, что при получении или культивировании штаммов с делецией SFP1 отбираются дополнительные мутации,улучшающие их жизнеспособность.Для того чтобы проверить, уникально ли это явление неполной компенсации делеции SFP1 для клонов Isp+ , мы использовали штамм отдалённо родственного происхождения 1Б-Д1606 и полученный на его основе штамм с делециейSFP1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
