Диссертация (1145883), страница 24
Текст из файла (страница 24)
рис. 3.38) и предполагаем, что фенотип Isp– создаётся за счёт совместного действия дупликациигенов his7-1 или lys2-87, TEF2 и, возможно, усиливается из-за дупликации геновсупрессорных тРНК.129Таким образом, наши данные показывают, что смена фенотипа с Isp+ наIsp– (повышение эффективности супрессии мутаций his7-1 и lys2-87) детерминирована появлением дополнительной хромосомы II, а обратный переход — потерей этой дополнительной хромосомы.Нельзя также исключить возможность участия других хромосом в модуляции исследуемого фенотипа. В частности, интересной представляется разница в интенсивности роста на среде без гистидина двух клонов Isp– , m1 иm2 (рис. 3.32), которые на уровне кариотипа отличаются копийностью хромосомы IX (см.
3.25). Наших данных недостаточно для того, чтобы подтвердитьили опровергнуть гипотезу о влиянии копийности хромосомы IX на эффективность роста на среде без гистидина, однако такую вероятность нельзя исключить. мРНК, несущая мутацию his7-1, является субстратом NMD (Chabelskayaet al., 2007), однако ни один из основных генов, участвующих в этом процессе,не расположен на хромосоме IX. Нельзя забывать также, что мы регистрируем уровень функционального белка His7 по росту штамма на среде без гистидина, что лишь косвенно отражает активность His7p через концентрацию гистидина. В пути биосинтеза L-гистидина из 5-фосфорибозил-1-пирофосфата 9реакций, кодируемых 7-ю ферментами (см. Rébora et al., 2005).
His7p катализирует шестую реакцию, субстратом для которой является фосфорибозилформимино-5-аминоимидазол-4-карбоксамидриботидфосфат, синтезируемый при участии фермента His6, кодируемого геном хромосомы IX (рис. 4.2). Нельзя исключить, что конечный выход гистидина может регулироваться и числом копийHIS6.С гипотезой об участии анеуплодии в детерминации фенотипа Isp– согласуется и нестабильность штаммов Isp– , показанная ранее и отмеченная такжев нашей работе. Согласно данным К. В. Волкова (Волков, 2000; Volkov et al.,2002), спонтанный переход от фенотипа Isp– к фенотипу Isp+ происходит с частотой 10-4 на клетку на поколение.
Эта величина согласуется с имеющимисяданными о частоте потери дополнительных хромосом у дисомных гаплоидныхштаммов — около 10-4 в случае дополнительной хромосомы III (Campbell et al.,1975; Surosky, Tye, 1985) или V (Campbell et al., 1975) и около 10-5 в случаедополнительной хромосомы VII (Hartwell et al., 1982; Esposito et al., 1982) —и несколько выше частоты спонтанного возникновения некоторых прионов (на-130пример, около 10-7 –10-5 для [PSI + ] (Lund, Cox, 1981; Lancaster et al., 2010) и 10-6для [PIN + ] (Huang et al., 2013) и [URE3] (Masison, Wickner, 1995; Shewmaker,Wickner, 2006).В нестабильность клонов Isp– вносит свой вклад то, что появляющиесяклоны Isp+ растут с большей скоростью (Volkov et al., 2002).
Это обстоятельство не может служить доказательством анеуплоидии, однако хорошо сочетаетсяс представлением о том, что многие дисомные штаммы растут хуже в оптимальных условиях (Torres et al., 2007). Следует отметить, что отбор анеуплоидныхпроизводных, которые растут хуже исходного штамма в оптимальных условиях,но лучше — при наличии определённых стрессоров, ранее показан при длительном культивировании штамма в неблагоприятных условиях.
Такой отбор анеуплоидов может являться способом быстрой адаптации к неблагоприятным условиям, за которой может следовать отбор уже более стабильных изменений, такихкак истинные мутации (Yona et al., 2012). Появление штаммов с изменённой копийностью хромосомы II в таких экспериментах пока не регистрировали. Темне менее, штаммы с дисомией по хромосоме II описаны ранее: их можно получить направленно с помощью исключительной цитодукции (переноса однойхромосомы; Torres et al., 2007), а также выявить при анализе спор, полученных в потомстве триплоидного гибрида (обычно в штаммах с множественнойанеуплоидностью; Charles et al., 2010; Zhu et al., 2012).
Кроме того, в нескольких исследованиях показан отбор штаммов с дополнительной хромосомой IIв противовес снижающим жизнеспособность генетическим манипуляциям. Вопервых, дисомные по хромосоме II клоны отбираются при сверхэкспрессии последовательностей, кодирующих полиглутаминовые пептиды; в данном случаедвижущей силой отбора является дупликация гена SUP45, снижающая токсичность полиглутаминовых пептидов (Gong et al., 2012).
Во-вторых, при делециилокуса HTA2-HTB2, кодирующего гистоны H2A и H2B, дупликация хромосомыII, несущей паралогичный локус HTA1-HTB1, становится одним из способов повышения жизнеспособности клеток (Libuda, Winston, 2006). Мы предполагаем,что наши данные являются примером отбора анеуплоидных производных приналичии стрессора, в качестве которого выступает токсичное вещество GuHCl(см.
раздел 4.4).1314.3. Идентичность штаммов, использованных различными исследователямив ходе изучения фенотипа Isp+Полученные данные приводят нас к вопросу об идентичности материаларазных исследований, посвящённых приону [ISP+ ] и фенотипу Isp+ .В частности, не вполне очевидно, идентичны ли исходный клон25-2В-П3982 супрессорного фенотипа (Isp– ) и клоны, полученных после спонтанного изменения его фенотипа на Isp+ и последующего пассирования этихклонов на среде, содержащей GuHCl (см.
рис. 1.11), однако этот вопрос вряд лиможет быть решён, поскольку исходный клон не сохранился. Можно предположить, что событие спонтанной смены фенотипа соответствовало отбору мутантаsup45-400. Это согласуется с данными о том, что введение копии SUP45 дикого типа на центромерной плазмиде в клоны Isp+ вызывает супрессию мутацийhis7-1 и lys2-87 (Аксенова и др., 2006), однако механизм тонкой регуляции эффективности нонсенс-супрессии в данном случае требует дополнительных исследований.Кроме того, следует отметить, что исходный мутант 25, полученный на основе штамма 132-ду8-Л28-2В-П3982, был отобран как спонтанный ревертант кпрототрофности по аденину и гистидину, то есть по супрессии мутаций ade1-14(UGA) и his7-1 (UAA), (см. раздел 1.4.5). В исследовании (Volkov et al., 2002) эффективность нонсенс-супрессии оценивали на среде с одновременной нехваткойгистидина и лизина.
В использованном в нашей работе штамме эффективностьсупрессии his7-1 очень низка (приблизительно на 2 порядка ниже, чем эффективность супрессии lys2-87; см. рис. 3.2), и различить рост клонов Isp– на среде,не содержащей ни гистидина, ни лизина, практически невозможно (данные непредставлены).Наконец, частота перехода от фенотипа Isp+ к фенотипу Isp– под воздействием GuHCl в штаммах, использованных в данной работе, составляет около5% для одного и 13% для другого изученного штамма (см.
раздел 3.6), что напорядок ниже значений, полученных ранее (97% для первого из них по даннымВолков, 2000; Аксенова, 2006). Это несоответствие имеет принципиальное зна-132чение, поскольку заставляет предположить, что механизм изменения фенотипа,которое наблюдали в этих экспериментах, может быть разным.Совокупность этих данных приводит нас к выводу о том, что штаммы, использованные в разных работах, посвящённых изучению обратимого измененияэффективности нонсенс-супрессии, (Volkov et al., 2002; Аксенова и др., 2006;Aksenova et al., 2007; Рогоза и др., 2009; Rogoza et al., 2010; Radchenko et al.,2011 и наша работа), различаются, но определить, в какой момент происходилокаждое из описанных изменений, не представляется возможным.4.4. Влияние GuHCl на появление клонов Isp–в потомстве клонов Isp+Механизм перехода от фенотипа Isp+ к фенотипу Isp– остаётся непонятным. Спонтанный переход от Isp+ к Isp– является довольно редким событием(величина порядка 10-7 для штамма 25-2В-П3982), но частота такого переходаувеличивается приблизительно в 33 раза при инкубации клеток на среде, содержащей GuHCl в концентрации не менее 5 мМ (Volkov et al., 2002; Аксенова,2006).
Этот эффект внешне схож с излечиванием дрожжевых прионов, однакоэто сходство может быть случайным. Потеря дрожжевых прионов в последовательных клеточных поколениях под воздействием GuHCl (i) может быть заметнадаже при концентрации 1 мМ в случае [PSI + ], (ii) не совпадает с направлениемотбора, поскольку клоны Ade– ([psi– ]) растут немного медленнее клонов Ade+([PSI + ]) (Tuite et al., 1981) и связана с блокировкой шаперона Hsp104 (Ferreiraet al., 2001). В то же время, (i) повышенная частота появления клонов Isp– впотомстве клонов Isp+ заметна только при концентрации GuHCl не ниже 5 мМ,что (ii) совпадает с тем, что клоны Isp– более устойчивы к GuHCl, чем клоныIsp+ , и разница заметна при содержании GuHCl в среде в концентрации не менее5 мМ (Аксенова, 2006), а (iii) ни делеция, ни сверхэкспрессия Hsp104 не влияютна фенотип клеток Isp+ (Volkov et al., 2002).Мишени GuHCl в дрожжевой клетке (кроме Hsp104p) изучены мало, и механизмы, приводящие к токсичности этого вещества, практически не известны.133Показано, что штаммы с делецией SSB1/2 или ERG6 гиперчувствительны к воздействию GuHCl из-за более активного поглощения этого вещества из среды инакопления гуанидина внутри клетки (Jones et al., 2003), и высказано предположение, что механизм токсичности совпадает для разных катионов, в том числеи гуанидиния, и связан с их транспортом через цитоплазматическую мембрану(Kim, Craig, 2005).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
