Диссертация (1145883), страница 22
Текст из файла (страница 22)
3.32).Isp+ (p1), контрольIsp+ (p1), his7-1,6Isp– (m1), контрольIsp+ (p3), контрольIsp+ (p3), his7-1,6Isp– (m2), контрольSC-UraSC-UraHisSC-UraLysРисунок 3.32 — Введение дополнительной копии his7-1 приводит к усилению роста на средебез гистидина. Показан пример результатов фенотипического анализа трансформантов указанных изолятов. Контроль, pRS316. his7-1,6, pRS316-his7-1,6.3.7.2. Доза гена sup45-400 не определяет различие фенотипов Isp+ и Isp–Ген SUP45 локализован в правом плече хромосомы II, а результаты анализа транскриптома показывают, что количество мРНК этого гена в изоляте Isp–приблизительно в 1,5 раза выше, чем в изоляте Isp+ , причём различие статистически значимо.
Различие клонов Isp+ и Isp– по уровню мРНК гена SUP45 исоответствующего белка было выявлено ранее (Радченко, 2014), и наши данныесогласуются с этими результатами (рис. 3.33, 3.34).119АБSUP45(транскриптом)16(ОТПЦР-РВ)-4**ΔCq (отн. ADH1)log2 интенсивности свеченияSUP4515141312*-5-6-7-8Isp+Isp–Isp+Isp–Рисунок 3.33 — Экспрессия sup45-400 в клонах Isp– выше, чем в клонах Isp+ .
Показанырезультаты транскриптомного анализа (А) и ОТПЦР-РВ (Б). * — < 0,05 (критерий Манна-Уитни). ** — < 0,01 (модифицированный t-критерий).Isp+БIsp–Sup45p(49 кДа)~ 55 кДа~ 35 кДа~ 25 кДаУровень Sup45p5Sup45p / тот. белокА43210Isp+Isp–Рисунок 3.34 — В клонах Isp– повышено количество белка Sup45. А — Представлена однаиз четырёх повторностей. Показаны результаты вестер-блот-гибридизации с антителами, специфичными к Sup45p (верхняя часть рисунка), и окраска Кумасси R-250 в качестве контролянанесения (нижняя часть). Б — результаты денситометрии (по оси ординат отложено отношениеоптической плотности сигнала антител к сигналу Кумасси).Ранее было показано, что введение дополнительной копии SUP45 дикоготипа на плазмиде в клоны Isp+ приводит к появлению нонсенс-супрессии, в товремя как введение дополнительной копии sup45-400 не изменяет Lys– фенотипклонов Isp+ (Аксенова и др., 2006).
Эти данные приобретают особенный интересв сочетании с полученными нами данными об увеличении дозы гена sup45-400и вызывают вопрос о том, влияет ли sup45-400 на формирование супрессорного фенотипа. Мы проверили это предположение двумя способами. Во-первых,120мы оценили эффективность роста на среде без гистидина при одновременнойтрансформации центромерными плазмидами, несущими his7-1,6 и sup45-400 ивыяснили, что введение sup45-400 не влияет на рост на среде без гистидина, т. е.эта аллель не действует как аллосупрессор.SC-ULeuIsp+SC-UraLeuHisSC-UraLeuLysконтрольhis7-1,6sup45-400sup45-400+his7-1,6SUP45–Isp , контрольРисунок 3.35 — Совместное добавление his7-1 и sup45-400 не приводит к супрессии в клонах Isp+ . Показаны результаты анализа фенотипа трансформантов Isp+ (p1) или Isp– (m1) с помощью посевов с разведениями или отпечатков на 11-й день инкубации.
Контроль, pRS315 +pRS316. his7-1,6, pRS315 + pRS316-his7-1,6. sup45-400, pGRS45-sup45-400 + pRS316. sup45-400+ his7-1,6, pGRS45-sup45-400 + pRS316-his7-1,6. SUP45, pRS315-SUP45 + pRS316.Во-вторых, мы предположили, что при наличии слабого аллосупрессорного эффекта он может проявляться при сверхэкспрессии соответствующей аллели.Для этого мы сконструировали мультикопийную плазмиду с sup45-400 и ввелиеё в клетки изолята Isp+ (p1). В то время как введение центромерной плазмиды с SUP45 дикого типа приводило к незначительному, а сверхэкспрессия этойаллели — к существенному усилению нонсенс-супрессии, добавление sup45-400собственного влияния не оказывало, а при сверхэкспрессии оказывало антисупрессорный эффект (рис.
3.36).Для того чтобы найти объяснение этим данным, мы оценили уровень белков Sup45 и Sup35 в клонах Isp+ , сверхэкспрессирующих разные аллели SUP45,по сравнению с контролем (трансформантами пустым вектором). Мы выяснили,что сверхэкспрессия sup45-400, в отличие от сверхэкспрессии SUP45 дикого типа, очень сильно увеличивает уровень обоих факторов терминации трансляции(рис. 3.37; медианные значения уровня белка повышаются в 10 и 3 раза соответственно).
Вероятно, именно это обстоятельство и объясняет влияние сверхэкспрессии sup45-400 на фенотип, однако точный механизм снижения эффективности нонсенс-супрессии при взаимодействии двух мутантных аллелей факторовтерминации трансляции остаётся не до конца понятным.121SC-LeuSC-LeuHisSC-LeuLysIsp+, контрольIsp–, контрольIsp+, ↑ SUP45Isp+, ↑ sup45-400Isp+, ↑↑ SUP45Isp+, ↑↑ sup45-400P4SU↑↑Sup45pSup35pSup45p / тот. белокБ554sup4↑↑рольконтА00Рисунок 3.36 — Введение SUP45 дикого типа в клетки Isp+ приводит к увеличению эффективности супрессии his7-1 и lys2-87, в то время как увеличение дозы sup45-400 приводит к противоположному эффекту, и в обоих случаях эффект усиливается при увеличении копийности гена.
Показан фенотип трансформантов изолята Isp+ (p1) или Isp– (m1) на 8-й день инкубации. Контроль,pRS425; ↑SUP45, pSU1; ↑↑SUP45, pRS425-SUP45; ↑sup45-400, pGRS45-sup45-400, ↑↑sup45-400,pRS425-sup45-400.Уровень Sup45p3210~ 55 кДа~ 35 кДаВSup35p / тот. белокконтроль ↑↑sup45-400↑↑SUP45Уровень Sup35p210контроль ↑↑sup45-400↑↑SUP45Рисунок 3.37 — Сверхэкспрессия sup45-400 приводит к более заметному повышению уровня белков Sup45 и Sup35, чем сверхэкспрессия SUP45 дикого типа. Показаны результаты вестерн-блот-гибридизации лизатов клеток Isp+ (p3) с антителами, узнающими Sup45p или Sup35p,а также результаты окраски мембраны Coomassie R-250.
Показана одна из биологических повторностей (А) и результаты денситометрии (Б и В для Sup45p и Sup35p соответственно; отложено отношение оптической плотности сигнала антител к сигналу Кумасси). Контроль, pRS425;↑↑SUP45, pRS425-SUP45; ↑↑sup45-400, pRS425-sup45-400.Таким образом, аллель sup45-400 не обладает собственным супрессорнымэффектом, а при сверхэкспрессии приводит к снижению эффективности супрессии. Совокупность полученных данных позволяет предполагать, что sup45-400122не участвует в формировании разницы в эффективности супрессии между клонами Isp+ и Isp– .3.7.3. Cверхэкспрессия некоторых генов тРНК и гена TEF2 увеличиваетэффективность нонсенс-супрессииНа хромосоме II локализован ген TEF2, для сверхэкспрессии которого показан аллосупрессорный эффект, и ген KTI11, делеция которого, согласно данным литературы, снижает эффективность нонсенс-супрессии (см. табл.
3.11).Можно предположить, что наличие в клонах Isp– дополнительной копии каждого из этих генов вносит свой вклад в увеличенную эффективность супрессииhis7-1 и lys2-87. Это предположение мы проверили с помощью введения сверхэкспрессионных плазмид, несущих эти гены, в штамм Isp+ . Для сверхэкспрессииKTI11 использовали плазмиды YGPM5g09 и YGPM11j01, несущие перекрывающиеся участки хромосомы II, включающие ген KTI11, а для сверхэкспрессииTEF2 — плазмиду YEplac181-TEF2 (см.
раздел 2.5.3). Ни для одной из плазмид сKTI11 мы не обнаружили влияния на жизнеспособность и эффективность нонсенс-супрессии, а сверхэкспрессия TEF2 приводила к повышенной эффективности супрессии обеих маркерных нонсенс-мутаций, сравнимой с таковой в контрольных клонах Isp– , и к заметному снижению жизнеспособности (рис. 3.38).Мы предполагаем, что в изучаемой системе, как и в описанной ранее (Матвеенкои др., 2013), TEF2 выступает как аллосупрессор.Наконец, мы предположили, что на супрессию может также влиять изменение дозы генов естественых супрессорных тРНК tQ(UUG)B и tC(GCA)B.Это предположение проверили с помощью трансформации клонов Isp+ мультикопийными плазмидами YGPM17c22 (содержит в том числе tQ(UUG)B),YGPM18o19 (содержит в том числе tC(GCA)B), а также рRS425-тРНКGln , несущей ген tQ(UUG)L, локализованный на хромосоме XII, однако кодирующий почти идентичную tQ(UUG)B молекулу тРНК (см. раздел 2.5.3).
Трансформацияизолята Isp+ плазмидой pRS425-тРНКGln , но не YGPM17c22, привела к небольшому повышению эффективности супрессии his7-1, не сравнимому, тем не менее, с эффективностью супрессии в клоне Isp– (рис. 3.38). Аналогичный эффектнаблюдали в случае плазмиды YGPM18o19 и мутации lys2-87 (рис. 3.38). Эти123данные могут говорить об участии генов tQ(UUG)B и tC(GCA)B, кодирующихестественные супрессорные тРНК, в формировании фенотипа Isp– .Isp+, контрольSC-LeuSC-LeuHisSC-LeuLysIsp–, контроль↑↑ tQ(UUG)LIsp+ ↑↑ tQ(UUG)B↑↑ tC(GCA)B↑↑ TEF2Рисунок 3.38 — Сверхэкспрессия tQ(UUG)L и некоторых генов, расположенных на хромосоме II, приводит к увеличению эффективности нонсенс-супрессии. Показан пример результатов анализа фенотипа трансформантов Isp+ (p3) и Isp– (m2). Контроль, pRS425.
↑↑ tQ(UUG)L,pRS425-тРНКGln ; ↑↑ tQ(UUG)B, YGPM17c22; ↑↑ tC(GCA)B, YGPM18o19.Совокупность полученных данных позволяет нам предполагать, что фенотип Isp– (повышенная эффективность супрессии his7-1 и lys2-87) формируется засчёт дупликации самих маркерных аллелей, в результате которой увеличиваетсямРНК his7-1 и lys2-87, а продукт также дуплицированного гена TEF2 способствует считыванию стоп-кодонов.
Нельзя исключить, что нонсенс-супрессия дополнительно усиливается дупликацией генов естественных супрессорных тРНКtQ(UUG)B и tC(GCA)B.124Глава 4. ОбсуждениеА мы все ставим каверзный ответИ не находим нужного вопроса.В. С. Высоцкий «Мой Гамлет»Это исследование посвящено выявлению механизмов, обеспечивающихтонкую регуляцию эффективности нонсенс-супрессии в штамме с миссенс-мутациями в обоих генах, кодирующих факторы терминации трансляции.
Явление спонтанного обратимого изменения эффективности нонсенс-супрессии быловпервые показано для штамма, маркированного несколькими нонсенс-мутациями и рецессивной супрессорной мутацией в гене SUP35. Позднее было показано,что утрата нонсенс-супрессии обусловлена появлением в клетках прионоподобного детерминанта [ISP+ ], возникающего в результате прионного превращениябелка Sfp1 (см. раздел 1.4.5), однако связь между Sfp1p, регулятором экспрессиигенов рибосомных белков, и наблюдаемым фенотипом, снижением эффективности нонсенс-супрессии, была не вполне очевидна.4.1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
