Диссертация (1145883), страница 18
Текст из файла (страница 18)
е. результаты транскриптомного анализа получили подтверждение.БRPS9ARPS9A(транскриптом)16(ОТ-ПЦР-РВ)ΔCq (отн. ADH1)log2 интенсивности свеченияА***141210-2**-4-6-8Isp+Isp–Isp+Isp–Рисунок 3.15 — Количество мРНК гена RPS9A в клонах Isp+ повышено по сравнению склонами Isp– . Показаны данные транскриптомного анализа (А) и данные ОТ-ПЦР-РВ (Б). *** — < 0,001 модифицированный t-критерий с поправкой Бенджамини-Хохберга); ** — < 0,01(критерий Манна-Уитни).Поскольку этот ген кодирует рибосомный белок S9, подобное изменениеэкспрессии может оказывать влияние на процесс трансляции.
Ген RPS9A не явля-95ется жизненно важным, т. к. в геноме дрожжей присутствует его паралог RPS9B,кодирующий почти идентичный белок (Vincent, Liebman, 1992); экспрессия этого гена в норме приблизительно на порядок выше, чем экспрессия RPS9A, как поданным нашего транскриптомного исследования, так и по данным других авторов (Vincent, Liebman, 1992; Pnueli, Arava, 2007). Для проверки предположенияоб участии гена RPS9A в контроле фенотипа Isp+ , т.
е. антисупрессии по отношению к мутации sup35-25, мы получили штамм с делецией гена RPS9A с помощью замещения его последовательности на последовательность гена kanMX,обеспечивающего устойчивость к антибиотику G418 (см. Материалы и методы).Мы получили 9 устойчивых к антибиотику трансформантов и проанализироваликорректность вставки в геномную ДНК с помощью ПЦР для 5 из них. Во всехслучаях вставка произошла корректно (типичный результат приведён на рис.3.16Б). Для одного из клонов инактивацию RPS9A дополнительно проверили поотсутствию амплификации в ОТ-ПЦР-РВ (рис. 3.17А).Потомки клона Isp+ с делецией гена RPS9A проявляли несупрессорныйфенотип на средах без лизина или гистидина, т.
е. соответствовали по фенотипуисходному клону Isp+ (рис. 3.16В). Таким образом, делеция RPS9A не влияет наэффективность нонсенс-супрессии.А(1) Isp+, rps9A Δ(2) Isp+, контрольIsp–, контрольВIsp+, rps9AΔIsp+, контрольIsp–, контрольYEPD, 3 д.G418, 3 д.БRPS9A(1) (2)kanMX(1) (2)1 т.п.н.SMC-AdeSMC-HisSMC-LysРисунок 3.16 — Делеция гена RPS9A не влияет на эффективность нонсенс-супрессии в клонах Isp+ . А и Б — доказательство делеции RPS9A. А — последовательные пятикратные разведенияна 3-й день роста. Б — электрофореграмма ПЦР-продуктов.
В случае штаммов с делецией RPS9Aамплифицируется только участок гена kanMX, в случае контрольных штаммов — только участокгена RPS9A. В — последовательные пятикратные разведения на селективных средах на 5-й деньроста.96Поскольку RPS9B в норме экспрессируется более активно, чем RPS9A (см.выше), сохранение несупрессорного фенотипа при делеции RPS9A может бытьсвязано с компенсацией отсутствия RPS9A за счёт усиления экспрессии RPS9B.Мы проверили это предположение с помощью количественной ПЦР в реальном времени и не обнаружили изменения экспрессии гена RPS9B в штамме сделецией гена RPS9A (3.17Б). Кроме того, в этом эксперименте мы подтвердили полученные при исследовании профилей экспрессии данные об отсутствииразницы в экспрессии RPS9B в клонах Isp+ и Isp– (3.17Б).АБRPS9AIsp+rps9AIsp+ΔCq (отн.
ADH1)ΔCq (отн. ADH1)*RPS9BIsp–Isp+rps9AIsp+Isp–Рисунок 3.17 — Делеция гена RPS9A не приводит к изменению экспрессии гена RPS9B.Показан относительный уровень RPS9A (А) или RPS9B (Б), измеренный с помощью ОТ-ПЦР-РВ.Каждая точка соответствует одному образцу (независимому выделению) РНК; линия отмечаетмедианный уровень.
В качестве референсного гена использовали ADH1. * — < 0,05 (критерийМанна-Уитни с поправкой Холма на множественные сравнения).Альтернативный подход к проверке влияния гена RPS9A на эффективностьсупрессии — сверхэкспрессия этого гена в клонах Isp– . Для этого мы сконструировали плазмиду p426GPD-RPS9A, несущую ген RPS9A под контролемGPD-промотора, на основе плазмиды p426GPDSWI1YFP с помощью замены последовательности SWI1-YFP на последовательность RPS9A.
Согласно даннымполногеномного секвенирования, аллель гена RPS9A в изучаемом штамме отличается от таковой в референсном штамме S288C тремя незначащими заменами вкодирующей области, а также заменой и трёхнуклеотидной делецией в интроне,однако по последовательности кодируемого белка Rps9A эти аллели совпадают.Мы подтвердили эти данные с помощью секвенирования ПЦР-продукта. В по-97лученной плазмиде секвенировали участки, соответствующие GPD-промоторуи гену RPS9A.
В GPD-промоторе замен не обнаружили. ПоследовательностьRPS9A соответствовала описанной выше.Введение плазмиды p426GPD-RPS9A в изолят Isp– (p3) не привело к изменению эффективности нонсенс-супрессии (рис. 3.18). Следовательно, ген RPS9Aне участвует в формировании фенотипа Isp+ .Isp–, ↑↑ RPS9ASC-UraSC-UraHisSC-UraLysIsp–, контрольРисунок 3.18 — Введение плазмиды, содержащей ген RPS9A под контролем GPD-промотора,не приводит к изменению эффективности нонсенс-супрессии в изоляте Isp– .
Показаны последовательные пятикратные разведения для типичных клонов. Всего было проверено 12 независимых трансформантов. ↑↑ RPS9A, p426GPD-RPS9A; контроль, pRS426.Наконец, мы высказали предположение, что изменение экспрессии RPS9Aможет являться не причиной, а, напротив, следствием изменённой эффективности терминации трансляции. Это предположение мы проверили, компенсировав дефект терминации трансляции в изоляте Isp– с помощью введения центромерной плазмиды pRSU2, несущей ген SUP35 дикого типа. Введение дополнительной копии SUP35 действительно привело к исчезновению или значительному снижению эффективности нонсенс-супрессии по отношению к мутациямade1-14 и lys2-87 (3.19А), причём это изменение фенотипа было обратимым,т.
к. нонсенс-супрессия восстанавливалась при прекращении отбора на поддержание плазмиды (3.19Б). При этом наблюдали увеличение количества мРНК генаSUP35 (3.19В), причём это увеличение было несколько больше двукратного, однако использованный метод не даёт возможности говорить о том, какую долюмРНК составляли продукты аллелей SUP35 и sup35-25. Тем не менее, разницав уровне RPS9A между клонами Isp+ и Isp– сохранилась и при компенсации нарушения терминации трансляции (рис. 3.20).
Совокупность данных позволяетнам уверенно утверждать, что уровень экспрессии гена RPS9A является яркойхарактеристикой, по которой отличаются клоны Isp+ и Isp– , но никак не связан сразличной эффективностью нонсенс-супрессии в этих штаммах.98АIsp+, контрольSC-UraSC-UraAdeSC-UraLysSC-AdeSC-LysIsp+, ↑ SUP35Isp–, контрольIsp–, ↑ SUP35БSCIsp+, контрольIsp+, ↑ SUP35Isp–, контрольIsp–, ↑ SUP35Уровень мРНК SUP35*****ΔCq (отн. ADH1)ВIsp+контрольIsp+↑ SUP35Isp–контрольIsp–↑ SUP35Рисунок 3.19 — Добавление копии SUP35 дикого типа компенсирует нарушение терминации трансляции как в клонах Isp+ , так и в клонах Isp– . Показаны результаты анализафенотипа трансформантов в селективных (А) и не селективных (Б) для поддержания плазмидыусловиях, а также анализ уровня мРНК с помощью ОТ-ПЦР-РВ SUP35 (В).
* — < 0,05 (попарный тест Манна-Уитни с поправкой Холма на множественные сравнения). ↑SUP35, pRSU2;контроль, pRS316. Зачёркнутое название вносимой конструкции применено для обозначенияклонов, отобранных после потери плазмиды.99Уровень мРНК RPS9A**ΔCq (отн. ADH1)**Isp+контрольIsp+↑ SUP35Isp–контрольIsp–↑ SUP35Рисунок 3.20 — Компенсация нарушения терминации трансляции не влияет на разницу вуровне мРНК RPS9A между клонами Isp+ и Isp– . Показаны результаты ОТ-ПЦР-РВ.
Контроль,pRS316; ↑SUP35, pRSU2. * — < 0,05 (попарный тест Манна-Уитни с поправкой Холма намножественные сравнения).3.3.5. Транскрипционные факторы, мишени которых различаются по уровнюэкспрессии в клонах Isp+ и Isp–Поскольку мы не обнаружили обогащённости промоторов генов с дифференциальной экспрессией сайтами связывания Sfp1p, можно предположить, чтоприонизация Sfp1p вызывает изменение активности других факторов транскрипции, регулирующих экспрессию выявленных генов. Чтобы ответить на вопрос,что это за транскрипционные факторы, мы провели анализ, аналогичный описанному в разделе 3.3.1, с учётом большинства известных транскрипционныхфакторов S.
cerevisiae. Гены, экспрессия которых активируется в клетках Isp+ ,являются мишенями Gcn4p и Aft1p; гены, экспрессия которых активируется вклетках Isp– , регулируются транскрипционными факторами Com2, Gis1, Rgm1,Rph1 и Msn4 (табл. 3.9).Следует отметить, что в случае с мишенями Msn4p изменение экспрессиигенов, скорее всего, обусловлено изменением активности его паралога Msn2p,100поскольку последовательность MSN4 в геноме изучаемого штамма содержитстоп-кодон (см. приложение Б).Таблица 3.9 — Транскрипционные факторы (ТФ), сайтами связывания которыхобогащены промоторы исследуемых генов.
Значения Z- и F-статистик округлены до целых.Характер изменения экспрессииПовышение в Isp+Повышение в Isp–ТФZFGcn4p4717Aft1p4111Com2p1611Gis1p1615Rgm1p1414Rph1p1211Msn4p1013Изменение активности перечисленных транскрипционных факторов можетбыть обусловлено либо изменением уровня транскрипции кодирующих их генов, либо регуляцией трансляции соответствующих мРНК, либо регуляцией напосттрансляционном уровне. Имеющиеся у нас данные позволяют проверитьпервое из этих предположений. Данные транскриптомного анализа показывают,что только два гена, кодирующие перечисленные в таблице 9 транскрипционные факторы, а именно COM2 и AFT1, различаются по экспрессии в клонахIsp+ и Isp– (p < 0,01).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
