Диссертация (1145883), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Показаны результаты ОТПЦР-РВ. РНК выделена из трансформантов Isp– (m2) плазмидами p426GPD-YFP, pRS426-SFP1 или p426GPDSWI1YFP. Каждая точка соответствует одномуобразцу (независимому выделению) РНК; линия отмечает медианный уровень. ** — < 0,01(попарное сравнение с помощью критерия Манна-Уитни с поправкой Холма).843.2.4. В потомстве трансформантов со сверхэкспрессией SWI1 появляютсяавтодиплоидные клоныСледует отметить ещё одну схожую черту сверхэкспрессии SFP1 и SWI1,кроме увеличения частоты возникновения клонов Isp+ : в обоих случаях наблюдали снижение скорости роста колоний трансформантов (рис. 3.10). Тем не менее,в случае трансформантов SWI1-YFP или SWI1QC-YFP мы обнаружили отдельные большие колонии, которые не были отмечены при сверхэкспрессии SFP1(рис.
3.10). Такие колонии появлялись при трансформации как изолятов Isp– , таки изолятов Isp+ .↑↑YFP↑↑SFP1↑↑SWI1-YFP↑↑SWI1QC-YFPРисунок 3.10 — При сверхэкспрессии SWI1-YFP и SWI1QC-YFP выявляются колонии двухтипов, отличающиеся по скорости роста. Показаны трансформанты изолята Isp+ (p1) плазмидами p426GPD-YFP, pRS426-SFP1, p426GPDSWI1YFP, p426GPDQCYFP на 5-й день инкубации.Последующий анализ таких крупных колоний в потомстве трансформантов изолята p1 показал, что большинство таких клонов, в отличие от исходногоизолята, очень хорошо растёт на средах без аденина или лизина (рис.
3.11А) ине способно скрещиваться с тестерными штаммами 78А-П2345 или 2Г-П2345,а также представлено более крупными по сравнению с исходным клоном клетками (рис. 3.11Б). Последние два обстоятельства позволили нам предположить,что появление крупных колоний объясняется автодиплоидизацией клеток.Для проверки этого предположения мы воспользовались методом проточной цитофлуориметрии (ПЦМ) с предварительной окраской ДНК красителемSybrGreen I. В этом случае распределение уровня флуоресценции клеток активно делящейся культуры должно иметь два выраженных пика, один из которых соответствует клеткам в фазе G0 или G1, а второй — в фазе G2, т. е.
суже удвоенным геномом. Предварительно для отработки метода выбрали референсные предполагаемые гаплоидные штаммы: клон p1 изучаемого штамма и85штамм 78А-П2345 — а также предполагаемый диплоидный штамм, полученныйпри их скрещивании. Оказалось, что штамм 78А-П2345 обладает двойным, аполученный в результате скрещивания штамм — тройным набором генетического материала (рис. 3.11В).
Тем не менее, полученные данные говорят о том,что использованную модификацию метода ПЦМ можно применять для анализаплоидности, и поэтому на следующем этапе мы использовали его для анализа двух не способных к скрещиванию клонов, полученных из крупных колоний, и выяснили, что оба клона представлены клетками с диплоидным наборомДНК (рис. 3.11Г). Таким образом, сверхэкспрессия SWI1 в клонах фенотипа Isp–может приводить к одному из трёх событий: сохранению исходного фенотипа,появлению быстро растущих диплоидных клонов супрессорного фенотипа и появлению клонов Isp+ , по фенотипу не отличимых от возникших спонтанно илипод действием сверхэкспрессии SFP1. Вопрос о том, одинаковы ли механизмы,приводящие к смене фенотипа с Isp– на Isp+ при сверхэкспрессии SFP1 и сверх-SMC-Ade SMC-Lys↑↑ SWI1-YFPКрупныеМелкиеКонтрольMATαАMATaэкспрессии SWI1-YFP, пока остается открытым.БГ1С2С 4С861СIsp+ (p1)Число клеток, тыс.В2С1,51,00,578А-П2345Число клеток, тыс.4С1,00,5p1 x78А-П2345Число клеток, тыс.3С 6С1,51,00,5102103104Интенсивность флуоресценции SybrGreen, у.
е.Рисунок 3.11 — Крупные колонии при сверхэкспрессии SWI1-YFP возникают в результатедиплоидизации клеток. А — результаты анализа фенотипа и типа спаривания потомков трансформантов p1 плазмидой p426GPDSWI1YFP и исходного клона. MATa — 2Г-П2345, MATα —78А-П2345. Б — микрофотография жидких культур контрольного и двух опытных клонов. В —результаты анализа контрольных штаммов методом ПЦМ и микрофотографии соответствующихкультур. Г — результаты анализа культур (Б) методом ПЦМ. Числа C соответствуют отношениюмедианы соответствующего пика к медиане наименьшего пика, округлённому до целых.
Масштабная линейка — 10 мкм.873.3. Влияние Isp-статуса штамма и делеции гена SFP1 на экспрессиюбелок-кодирующих генов дрожжейРанее была высказана гипотеза о том, что причиной снижения эффективности нонсенс-супрессии в изолятах Isp+ является прионизация Sfp1p (Rogozaet al., 2010; см.
раздел 1.4.5). Тем не менее, имеющиеся данные не давали ответа на вопрос о том, каким образом депонирование транскрипционного фактора в агрегатах может влиять на эффективность нонсенс-супрессии. Возможно,этот эффект опосредован накоплением мутантного белка Sup35, обнаруженнымв изолятах Isp+ (Radchenko et al., 2011; см. раздел 1.4.5), однако связь междуагрегацией Sfp1p и увеличением количества Sup35p остаётся неочевидной. Поскольку Sfp1p является регулятором транскрипции и может влиять на экспрессию множества генов, мы проанализировали характер экспрессии большинствагенов в изолятах Isp+ , Isp– и sfp1Δ методом гибридизации РНК с ДНК-микрочипом; этот анализ позволил получить данные по экспрессии каждой из 6225ORF, содержащихся в геноме дрожжей.
Для анализа использовали РНК, независимо выделенную из четырёх клонов каждого изолята; для этих экспериментовиспользованы изоляты p2 (Isp+ ) и m2 (Isp– ), а также штамм sfp1Δ.Сравнение экспрессии генов проводили методом построения линейной модели для экспрессии гена, реализованным в пакете limma (см.
раздел 2.7.4). Число ORF, экспрессия которых признаётся изменённой, в данном случае зависитот пороговых значений двух параметров: p-значения и кратности изменения экспрессии (отношения усреднённого значения экспрессии генов в сравниваемыхштаммах).В данном анализе генами с изменённой экспрессией (далее — DEG, от англ. Differentially Expressed Genes) признавали гены, для которых p-значение,скорректированное по методу Бенджамини-Хохберга, составило менее 0,001, акратность изменения экспрессии — более 1,4, т. е. абсолютное значение двоичного логарифма отношения средних значений экспрессии было выше 0,5.
Логарифмирование в данном случае применено для удобства сравнения данныхдля генов, экспрессия которых изменяется различным образом (ослабляется илиусиливается) в одном из исследуемых штаммов по отношению к другому; для88удобства дальнейших вычислений использовано абсолютное значение этого параметра (abslogFC). Строгое ограничение критического p-значения и нестрогоеограничение порогового изменения экспрессии позволило нам проанализировать практически все гены, данные по которым позволяли уверенно говорить оразнице в уровне их экспрессии; выбор таких параметров был связан с тем, чтофизиологическая значимость изменения экспрессии конкретного гена зависит отмногих параметров и не обязательно связана с кратностью этого изменения.Общая характеристика распределения DEG для трёх возможных попарныхсравнений транскрипционных профилей штаммов представлена на рис.
3.12. Нарисунке видно, что штамм с делецией SFP1 отличается от каждого из штаммовIsp+ и Isp– намного сильнее, чем последние различаются между собой. Списокгенов, экспрессия которых статистически значимо различается в клонах Isp+ иIsp– , приведён в приложении В.А Isp+ / Isp–10В sfp1Δ / Isp–1010n=1043 n=899886664442220008-log10pБ sfp1Δ / Isp+n=74n=258-6 -4 -20246-6 -4 -20246n=787n=986-6 -4 -20246log2 кратности изменения экспрессииРисунок 3.12 — График рассеяния, показывающий общее распределение разницы профилей экспрессии в каждой из трёх возможных пар штаммов.
Показаны результаты для следующих пар штаммов: Isp+ и Isp– (А), Isp+ и sfp1Δ (Б) и Isp– и sfp1Δ (В). На оси абсцисс отложен двоичный логарифм от значения кратности изменения экспрессии, на оси ординат — отрицательныйдесятичный логарифм скорректированного по методу Бенджамини-Хохберга p-значения. DEGвыделены красным, если экспрессия соответствующего гена выше в первом из перечисленных взаголовке штаммов, и зелёным, если во втором.
Указано число DEG (p < 0,001, abslogFC > 0,5)в каждом случае.893.3.1. В клетках Isp+ , в отличие от клеток sfp1Δ, не снижена экспрессиямишеней Sfp1pРанее мы уже отмечали, что штаммы Isp+ и sfp1Δ различаются по целому ряду признаков (см. раздел 1.4.5). Данные по экспрессии генов (рис. 3.12Б)согласуются с этими результатами, но не проясняют вопрос о связи SFP1 с фенотипом Isp+ . Тем не менее, возможно предположить, что при переходе Sfp1pв прионную форму (предположительно в состав амилоида) происходит его частичная инактивация или, напротив, повышение активности. В таком случае гены, экспрессия которых изменяется при переходе Sfp1p в прионную форму (т. е.DEG, выявляемые при сравнении клонов Isp+ и Isp– ), должны содержать мишениSfp1p.В литературе есть информация о специфичной последовательности, распознаваемой Sfp1p при связывании с ДНК.
Эта последовательность определена invitro (Zhu et al., 2009); позже было показано, что делеция таких участков в промоторах некоторых генов рибосомных белков приводит к значительному снижению экспрессии репортерного гена, находящегося под контролем этих промоторов (Zeevi et al., 2011). Для анализа того, изменяется ли связывание Sfp1p с этойпоследовательностью при изменении фенотипа, мы воспользовались алгоритмом oPOSSUM Yeast SSA. Результаты анализа представлены в табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
