Диссертация (1145883), страница 15
Текст из файла (страница 15)
раздел2.5.3).3.2.1. Сверхпродукция Swi1p, но не других аспарагин-глутамин-богатыхрегуляторов транскрипции, увеличивает частоту появления клонов Isp+ впотомстве клонов Isp–Часть экспериментов, описанных в этом разделе, проведена совместно сТ. М. Рогозой. Все эксперименты проводили по одному и тому же общему плану: трансформировали изолят Isp– , отбирали не менее 75 независимых трансформантов каждой из плазмид, после чего проверяли фенотип на средах, одновременно обеспечивающих поддержание плазмиды (не содержащих урацилаили лейцина в зависимости от использованного плазмидного вектора) и позволяющих оценить эффективность нонсенс-супрессии (не содержащих гистидинаили лизина). Впоследствии клоны, изменившие фенотип на His– Lys– , триждыпассировали на полной среде, а затем переносили на селективные среды безурацила или лейцина, позволяющие оценивать наличие плазмиды, а также безгистидина или лизина для оценки эффективности супрессии каждой из маркерных мутаций his7-1 и lys2-87 соответственно.
Клоны, которые потеряли плазмиду (фенотип Ura– или Leu– ) и обладали несупрессорным фенотипом (His– Lys– ),учитывали как клоны Isp+ . В случае, если оценка супрессорного фенотипа была затруднена или потери плазмиды добиться не удавалось, полученные изолятысеяли истощающим штрихом с целью получения отдельных колоний и аналогичным образом переносили на селективные среды. Если более половины колонийсоответствовали выдвинутым критериям, клон учитывали как Isp+ .Следует отметить, что разные изоляты Isp– существенно отличаются почастоте спонтанного выщепления клонов фенотипа Isp+ в потомстве трансформантов (от полного отсутствия до 50%), причём эта частота возрастает в течениекультивирования из-за того, что спонтанно возникшие клетки Isp+ делятся быстрее.
По этой причине в каждом эксперименте отдельно оценивали число клонов,спонтанно приобретших фенотип Isp+ после трансформации контрольной плазмидой. Если доля таких клонов превышала 25%, результаты эксперимента далеене учитывали.78Полученные данные (табл. 3.3) свидетельствуют о том, что сверхэкспрессия SWI1, подобно сверхэкспрессии SFP1, приводит к статистически значимомуувеличению частоты появления клонов Isp+ . Для остальных изученных Q/Nбогатых белков такого эффекта не обнаружили (табл.
3.3), хотя различие конструкций, использованных для сверхэкспрессии разных генов, не позволяет намнепосредственно сравнивать эти эксперименты и, соответственно, сделать уверенный вывод об отсутствии влияния других изученных белков.Таблица 3.3 — Сверхэкспрессия гена SWI1 приводит к увеличению частотывозникновения клонов Isp+ по сравнению со спонтанным уровнем.% клонов Isp+Генпосле временнойсверхэкспрессииВсего трансформантов% спонтанновозникшихклонов Isp+Всего трансформантовCYC85,2%967,3%96MOT32,1%2351,3%23721,1%***3551,4%2861,0%1001,1%96SWI1-YFPURE2*** — < 0,001 (точный тест Фишера с поправкой Холма).793.2.2. Влияние сверхпродукции Swi1p на частоту появления клонов Isp+ несвязано с его агрегациейМожно предложить несколько возможных механизмов влияния SWI1 наизучаемый признак.
В частности, можно предположить, что:1. изменение фенотипа связано с возникновением приона [SWI + ];2. взаимодействие Swi1p и Sfp1p приводит к увеличению частоты агрегации последнего за счёт коагрегации или за счёт конкуренции за шапероны;3. сверхэкспрессия SWI1 приводит к увеличению экспрессии SFP1, в результате которого и возникают клоны Isp+ .Для проверки первых двух предположений достаточно проверить, сохраняется ли эффект в условиях заведомого отсутствия приона [SWI + ] и вообщеагрегации белка Swi1-YFP. Для этого провели две серии экспериментов.Известно, что для поддержания приона [SWI + ], как и большинства других прионов, необходим шаперон Hsp104 (Du et al., 2008), в то время как детерминант [ISP+ ] способен поддерживаться в отсутствие Hsp104 (Volkov et al.,2002), а в клетках с делецией HSP104 можно индуцировать возникновение [ISP+ ]с помощью сверхэкспрессии SFP1 (Rogoza et al., 2010). Мы инактивировалиген HSP104 с помощью замены его последовательности на последовательность,обеспечивающую устойчивость к гигромицину B, в изоляте Isp– (m3).
Корректность изменения генома у отобранных на среде с гигромицином B клонов проверяли с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими ген HSP104: в случае замены HSP104 ожидали появления продукта меньшего молекулярного веса.Отобранный штамм (обозначен (1) на рис. 3.6) удовлетворял этому требованиюи сохранил фенотип Isp– .80(1) (2)YEPD(1) Isp–, hsp104ΔIsp–, контрольYEPD +hygBSMC-Lys3 т.п.н.(2) Isp+, контроль1 т.п.н.Рисунок 3.6 — Делеция гена HSP104 не изменяет фенотип изолята Isp– (m3).
Показанырезультаты анализа фенотипа (левая часть рисунка) и электрофореграмма ПЦР с праймерами,фланкирующими ген HSP104 (правая часть рисунка). Цифрами обозначены клоны, геномнаяДНК которых послужила источником матрицы для ПЦР.Полученный штамм Isp– с делецией HSP104 использовали для сверхэкспрессии SWI1 по описанной выше схеме. Мы обнаружили, что влияние сверхэкспрессии SWI1 на частоту появления клонов Isp+ сохраняется при инактивацииHSP104 (табл. 3.4); следовательно, наблюдаемый эффект не связан с возникновением приона [SWI + ].Таблица 3.4 — Сверхэкспрессия гена SWI1 приводит к увеличению частотывозникновения клонов Isp+ по сравнению со спонтанным уровнем в штамме с делециейHSP104.% клонов Isp+Генпосле временнойсверхэкспрессииSWI1-YFP***46,8%Всего трансформантов237% спонтанновозникшихклонов Isp+0,8%Всего трансформантов240*** — < 0,001 (точный тест Фишера).Тем не менее, возможно, что на изучаемый феномен влияет возникновениенеприонных агрегатов белка Swi1. Присутствие в использованной конструкцииYFP позволило нам изучить внутриклеточное расположение Swi-YFP (рис.
3.7) вклетках Isp– . В части клеток мы наблюдали яркие фокусы флуоресценции неправильной формы (рис. 3.7, левая панель), что согласуется с известными данными(Du et al., 2008). В литературе также описана конструкция SWI1QC, кодирующая белок Swi1, лишённый N-концевого аспарагин-богатого участка.
Эта конструкция функциональна, поскольку компенсирует отсутствие SWI1 в геноме,но продуцируемый белок не образует агрегатов (Du et al., 2010). Мы воспользовались плазмидой, кодирующей SWI1QC-YFP под контролем GPD-промотора,81и выяснили, что в большинстве клеток Isp– сигнал на канале YFP зарегистрирован не был, а в случае наличия сигнала он был менее интенсивным, чем притрансформации плазмидой с полноразмерным геном SWI1-YFP (рис. 3.7, праваяпанель).SWI1-YFPYFPПроходящий свет+ YFPSWI1QC-YFPYFPПроходящий свет+ YFPРисунок 3.7 — Полноразмерный белок Swi1-YFP, в отличие от укороченного вариантаSwi1QC-YFP, образует яркие фокусы свечения в дрожжевых клетках. Показаны клетки изолята Isp– (m2), трансформированные плазмидой p426GPDSWI1YFP.
Масштабная линейка соответствует 10 мкм.Тем не менее, оказалось, что сверхэкспрессия (SWI1QC-YFP) приводит кувеличению частоты возникновения клеток Isp+ в потомстве трансформантов,подобно сверхэкспрессии SWI1-YFP и SFP1. Мы сравнили частоты возникновения клонов Isp+ при сверхэкспрессии разных генов, используя 6 различных изолятов Isp– . Для анализа полученных данных (табл.
3.5) применили обобщённуюлинейную модель, в которой независимой переменной являлся фактор «ген», азависимой — соотношение клонов Isp+ и Isp– после сверхэкспрессии этого гена.Все уровни фактора оказывали статистически значимое влияние на изучаемыйпризнак, то есть отличались от влияния сверхэкспрессии гена YFP ( < 0,001).Для сравнения влияния разных генов применили метод апостериорного анализа Тьюки, который показал, что влияние сверхэкспрессии SFP1 статистическизначимо выше, чем SWI1-YFP ( < 0,05) и SWI1QC-YFP ( < 0,01), а влияниеSWI1-YFP и его укороченного варианта статистически значимо не различается.82Таблица 3.5 — Аспарагин-богатый участок белка Swi1 не участвует в контроле частотывозникновения клонов Isp+ при сверхпродукции этого белка.Изолят–Isp% Клонов Isp+ после временной сверхэкспрессии генаSFP1SWI1-YFPSWI1QC-YFPYFPm216,7%10,3%9,0%0%m347,3%30,8%23,1%2,6%m434,6%16,7%7,7%0%m520,5%14,1%15,4%0%m624,4%16,7%23,1%0%В случае сверхэкспрессии YFP проанализировано по 75 независимых трансформантов для каждого изолята; в случае остальных конструкций — по 78 независимых трансформантов.Наконец, для дополнительной проверки предположения о взаимодействиибелков Swi1-YFP и Sfp1 воспользовались известными данными о преимущественно ядерном расположении агрегатов Sfp1p (Rogoza et al., 2010).
Ядра клеток, экспрессирующих SWI1-YFP, окрашивали DAPI, после чего сравнивали области свечения YFP и DAPI. Из 47 клеток, в которых был зарегистрирован чётколокализованный сигнал на обоих каналах, области флуоресценции пересекалисьтолько в 2 и не пересекались в остальных 45 случаях (типичный пример показанна рис. 3.8).YFPDAPIПроходящий свет КомбинированноеизображениеРисунок 3.8 — Агрегаты Swi1-YFP расположены вне ядер. Показано предположительное расположение ядер (окраска DAPI) и расположение агрегатов белка Swi1-YFP в клетках изолята Isp–(m2), трансформированного плазмидой p426GPDSWI1YFP. Масштабная линейка соответствует10 мкм.Совокупность полученных данных позволяет заключить, что повышеннаячастота появления клонов Isp+ в потомстве клонов Isp– после сверхэкспрессииSWI1 не связана с агрегацией белка Swi1 или индукцией приона [SWI + ].833.2.3.
Влияние сверхэкспрессии SWI1 на частоту появления клонов Isp+ несвязано с изменением уровня мРНК SFP1Можно также предположить, что полученные данные объясняются влиянием сверхэкспрессии SWI1 на уровень экспрессии SFP1. Для проверки этогопредположения из потомков клона Isp– , сверхпродуцирующих YFP (отрицательный контроль), Sfp1p (положительный контроль) или Swi1-YFPp, выделили РНКи получили на её матрице кДНК, которую использовали для сравнения уровнямРНК SFP1 в количественной ПЦР. Полученные данные (рис. 3.9) говорят о том,что сверхэкспрессия SWI1-YFP не изменяет уровень мРНК SFP1 — следовательно, механизм появления клонов Isp+ при сверхэкспрессии SWI1-YFP не связан сусилением экспрессии SFP1.Уровень мРНК SFP1**ΔCq (отн. ACT1)**YFPSFP1SWI1-YFPРисунок 3.9 — Сверхэкспрессия SWI1-YFP не приводит к изменению уровня экспрессииSFP1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
