Диссертация (1145883), страница 17
Текст из файла (страница 17)
3.6. Авторыалгоритма советуют обращать внимание на значения Z-статистики более 10 иF-статистики более 7. Этим параметрам соответствуют списки генов, экспрессия которых изменена в штамме sfp1Δ по сравнению с каждым из штаммов снормальной копией SFP1. Обогащённость промоторов этих генов сайтами связывания Sfp1p хорошо согласуется с литературными данными и подтверждаетадекватность выбранного метода анализа. В то же время, промоторы генов, экспрессия которых различается в клонах Isp+ и Isp– , не обогащены сайтами связывания Sfp1p.
Следовательно, эти штаммы не различаются по уровню экспрессиимишеней Sfp1p. Для дополнительной проверки того, что этот вывод не связанс меньшим объёмом выборки для DEG в сравнении Isp+ /Isp– , мы сформировалипо 3 случайные выборки из DEG в сравнениях sfp1Δ/Isp+ и sfp1Δ/Isp– , соответствующие по объёму длинам списков DEG в сравнении Isp+ /Isp– , и повторилианализ; были получены аналогичные результаты, т. е. обогащённость генами с90сайтом связывания Sfp1p в промоторной области (данные не представлены). Таким образом, активность Sfp1p как транскрипционного фактора в клонах Isp+ иIsp– не различается.Таблица 3.6 — Результаты анализа представленности сайта связывания Sfp1p впромоторах DEG.
Полужирным шрифтом выделены группы генов, частота встречаемостисайтов связывания Sfp1p в промоторной области которых статистически значимо выше, чем вслучайной выборке генов из генома. Промоторной областью считали 500 п.н.,предшествующих началу гена. Значения Z- и F-статистик округлены до целых.Сравнение Характер изменения экспрессии Число генов в группе / ZFпроанализированоIsp+ /Isp–повышение74/74-10Isp+ /Isp–снижение258/258-70sfp1Δ/Isp– повышение787/784-13 0sfp1Δ/Isp– снижение986/98468 77sfp1Δ/Isp+ повышение899/895-15 0sfp1Δ/Isp+ снижение1043/99970 823.3.2.
В клетках Isp+ не изменена транскрипция большинства генов биогенезарибосом и генов рибосомных белковИзвестно, что Sfp1p принимает участие в регуляции экспрессии генов биогенеза рибосом и генов рибосомных белков (см. раздел 1.2.1). Следовательно,уровень экспрессии этих генов можно использовать как дополнительный показатель, косвенно отражающий активность Sfp1p.Для более детального изучения вопроса о том, связано ли переключениефенотипа с Isp+ на Isp– с изменением в биогенезе рибосом, мы сравнили список генов, экспрессия которых различается в каждой паре штаммов, со спискомгенов Ribi (GO:0042254) и со списком генов белков цитоплазматической рибосомы. Результаты анализа представлены в табл.
3.7. Видно, что в то время какв штамме с делецией SFP1 изменяется экспрессия большого количества изучаемых генов при сравнении его с любым из двух изолятов с нормальной копиейSFP1 (следует даже отметить, что при сравнении с изолятом Isp+ число такихгенов выше), при сравнении клонов Isp+ и Isp– мы выявили лишь единичныегены с изменённой экспрессией.
Эти данные свидетельствуют о том, что пере-91ход между состояниями Isp+ и Isp– не связан с изменением экспрессии геновбиогенеза рибосом.Таблица 3.7 — Число генов Ribi и RP, экспрессия которых статистически значиморазличается в каждом из трёх попарных сравнений.ФункциональнаяОбщее чис-группало геновЧисло генов, экспрессия которыхстатистически значимо различаетсяв штаммах:Isp+ и Isp–sfp1Δ и Isp+ sfp1Δ и Isp–гены Ribi2262 (RPS9A, TMA108)138123гены RP1381 (RPS9A)5138Тем не менее, как видно из таблицы 3.7, исследованные изоляты Isp+ и Isp–статистически значимо различаются по экспрессии двух генов из интересующихнас групп.
Это гены RPS9A, который встречается в таблице 3.7 дважды, поскольку входит и в группу Ribi, и в группу RP, и TMA108 (рис. 3.13А, Б). Кроме того,указанные изоляты различаются по экспрессии гена CRF1 (рис. 3.13В). Этотген не аннотирован как ген Ribi, но его продукт является штаммоспецифичнымрепрессором транскрипции генов рибосомных белков (см. раздел 1.2.1). Экспрессия самого SFP1 в клетках Isp+ и Isp– не различалась (рис. 3.13Г).
Следуеттакже отметить, что интенсивность свечения в штамме sfp1Δ составляет около10 условных единиц (ось ординат представлена в логарифмическом масштабе) —следовательно, свечение такой интенсивности соответствует уровню, сигнал ниже которого следует считать неспецифическим. Влияние генов CRF1 и RPS9A наизучаемый фенотип было решено изучить более подробно. Ген TMA108 расположен на хромосоме IX и не был более подробно изучен по причинам, которыестанут понятны позже.92log2 интенсивности свеченияА14RPS9A******БTMA108***ВCRF1ГSFP1******12***********10864Isp+ Isp– sfp1ΔIsp+ Isp– sfp1ΔIsp+ Isp– sfp1ΔIsp+ Isp– sfp1ΔРисунок 3.13 — Уровень экспрессии генов RPS9A (А), TMA108 (Б), CRF1 (В) и SFP1 (Г)по результатам анализа профилей экспрессии. Каждая точка соответствует одному образцу(независимому выделению) РНК; линия отмечает медианный уровень.
** — < 0,01; *** — < 0,001 (модифицированный t-критерий с поправкой Бенджамини-Хохберга).3.3.3. Делеция гена CRF1 не влияет на проявление фенотипа Isp+Поскольку Crf1p может действовать как корепрессор генов рибосомныхбелков, мы решили проверить, контролирует ли ген CRF1 эффективность нонсенс-супрессии. Для этого мы инактивировали этот ген в изолятах Isp+ (p2)и Isp– (m2) и в клоне штамма sfp1Δ. Делецию проводили с помощью трансформации гибридным ПЦР-продуктом, содержащим ген kanR , обеспечивающийустойчивость к антибиотику G418, а также по 50 нуклеотидов, соответствующих фланкирующим ген CRF1 областям, с последующим отбором устойчивыхк G418 клонов (см.
раздел 2.5.6). Полученные штаммы дополнительно клонировали, после чего из потомков двух колоний каждого трансформанта выделялигеномную ДНК, которую использовали в качестве матрицы для ПЦР. Мы смоглиотобрать два клона в потомстве изолята Isp– и один клон в потомстве изолятаIsp+ , геномная ДНК которых содержала нужную вставку (3.14, правая часть); впотомстве клона sfp1Δ таких клонов обнаружить не удалось (табл.
3.8).93Таблица 3.8 — При получении делеции CRF1 в потомстве трансформантов выщепляютсяклоны, содержащие как ген CRF1, так и ген kanMX.Исходный клонНаличие продукта:Ген CRF1 kanMX Оба продуктаIsp+ (p2)011Isp– (m2)127sfp1Δ105Появление устойчивых к действию G418 клонов, содержащих интактныйген CRF1 (столбец 2 в табл. 3.8), скорее всего, свидетельствует об интеграциикассеты в другое место генома, а наличие обоих продуктов (столбец 4) можетобъясняться дупликацией участка хромосомы IV, содержащего ген CRF1. В совокупности эти данные могут свидетельствовать об отборе, происходящем приинактивации гена CRF1, и заставляют нас с осторожностью интерпретироватьрезультаты анализа клонов с делецией. Тем не менее, мы можем сказать, чтоотобранные клоны с делецией CRF1 по фенотипу принципиально не отличалисьот соответствующих им исходных клонов Isp+ и Isp– (рис.
3.14, левая часть), чтосвидетельствует против участия CRF1 в формировании фенотипа Isp+ .(1) Isp+, crf1Δ(2) Isp+, контроль(3) Isp–, crf1Δ(4) Isp–, контрольYEPDSC-LysG418CRF1 kanMX(1) (2) (1) (2)1 т.п.н.YEPDSC-LysG418CRF1 kanMX(3) (4) (3) (4)1 т.п.н.Рисунок 3.14 — Делеция CRF1 не оказывает значительного влияния на эффективностьсупрессии lys2-87 в клонах Isp+ и Isp– . Показаны последовательные пятикратные разведения(левая часть рисунка) и электрофореграмма ПЦР-продуктов (правая часть рисунка).
В случаештаммов с делецией CRF1 амплифицируется только участок гена kanMX, в случае контрольныхштаммов — только участок гена CRF1.943.3.4. Делеция и сверхэкспрессия гена RPS9A не влияют на проявлениефенотипа Isp+Согласно результатам транскриптомного исследования, уровень мРНК генаRPS9A в клоне Isp+ приблизительно в 16 раз выше, чем в клоне Isp– .
Эти данные представляют особенный интерес потому, что различия в уровне экспрессииRPS9A в исследованных клонах разного фенотипа не коррелируют с различиямидля других генов рибосомных белков: в то время как экспрессия большинствагенов рибосомных белков снижается при делеции SFP1 и не различается в клонах Isp+ и Isp– (табл. 3.7), экспрессия RPS9A одинакова в изолятах Isp– и sfp1Δ,однако значительно выше в изоляте Isp+ (см.
рис. 3.13). Для того чтобы исключить методическую ошибку, этот результат проверили методом количественнойПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ), причём изолят Isp+ (p3) получили на основе изолята Isp– (m2), чтобы обеспечить максимальное генетическое сходствосравниваемых клонов. Отношение средних значений экспрессии RPS9A в штаммах Isp+ и Isp– , определённое методом ОТ-ПЦР-РВ, составило 7,1 (рис. 3.15Б),т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
