Диссертация (1145883), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Следует отметить, что характер изменения экспрессиирегулятора и его мишеней в обоих случаях совпал: зарегистрировано повышение экспрессии в 1,7 раз для AFT1 и снижение экспрессии в 1,7 раз для COM2.Наиболее простое предположение состоит в том, что изменение активности этихтранскрипционных факторов обусловлено изменением количества соответствующих мРНК, однако эта гипотеза требует дополнительной экспериментальнойпроверки. Изменение активности остальных транскрипционных факторов, может быть обусловлено регуляцией на транскрипционном или посттранскрипционном уровне, однако механизмы этой регуляции нам не известны.1013.3.6.
Функциональная классификация генов, экспрессия которыхизменяется при делеции SFP1 или изменении фенотипа c Isp– на Isp+Для дополнительной характеристики выявленных DEG мы применили метод функциональной классификации, реализованный в Yeastmine (см. раздел2.7.4). Эта программа позволяет получить список терминов GO, частота встречаемости которых в списке генов с изменённой экспрессией больше, чем в целом по геному. Обработка даже таких результатов вручную достаточно сложнатехнически, поэтому мы использовали программу REVIGO, которая позволяетсократить такую таблицу, объединив близкие по значению термины GO.Данные представлены в приложении Г.
Делеция SFP1 снижает экспрессиюгенов, контролирующих такие биологические процессы, как синтез рибонуклеопротеиновых комплексов (в первую очередь рибосом) и метаболизм некоторых типов РНК. Наши данные об участии SFP1 в регуляции биогенеза рибосомсогласуются с имеющимися в литературе.Гены, экспрессия которых усилена в клонах Isp+ по сравнению с клонамиIsp– , контролируют такие процессы, как транспорт ионов металлов, в первуюочередь катионов железа, ответ на воздействие феромонов и конъюгацию, биосинтез аргинина и трансляцию, однако гены, экспрессия которых в клонах Isp+ослаблена, не объединены практически никакими общими функциями. Данныео функциональной принадлежности генов с усиленной экспрессией в клонахIsp+ хорошо согласуются с результатами анализа их промоторных областей: такие гены являются мишенями Gcn4p и Aft1p (табл.
3.9). Белок Gcn4 активируетбиосинтез аминокислот при недостатке какой-нибудь из них в среде (см. Zamanet al., 2008). Белок Aft1 активирует транспорт железа при недостатке этих ионов(см. Cyert, Philpott, 2013), а при наличии ионов железа диссоциирует от промоторов регулируемых генов (Ueta et al., 2012).3.3.7. В клетках Isp+ активирована транскрипция генов белков клеточнойстенки и генов, контролирующих импорт ионов железаКак сказано выше, в клонах Isp+ активирована экспрессия многих генов,имеющих отношение к импорту ионов железа и других металлов в дрожжевуюклетку (приложение Г).102Для дополнительной проверки этих данных мы получили изолят Isp+ p3на основе изолята m2 (для этого изолят m2 подвергли сверхэкспрессии SFP1 споследующей потерей плазмиды), после чего сравнили экспрессию некоторыхвыявленных ранее DEG в p3 и m2 с помощью ОТ-ПЦР-РВ.
Мы выбрали гены FIT2 и FIG1. FIT2 кодирует маннопротеин клеточной стенки, участвующийв удержании сидерофоров (Protchenko et al., 2001), а его экспрессия зависитот Aft1p (Foury, Talibi, 2001); FIG1 кодирует интегральный белок клеточнойстенки, необходимый для спаривания (Erdman et al., 1998). Данные ОТ-ПЦР-РВсогласуются с результатами транскриптомного анализа (рис. 3.21).БFIT2(ОТ-ПЦР-РВ)ΔCq (отн.
ADH1)-01210*-48-6Isp–-10***10-2Isp+Isp–FIG1(ОТ-ПЦР-РВ)(транскриптом)12***Isp+ГFIG1*ΔCq (отн. ADH1)log2 интенсивности свечения(транскриптом)14ВFIT2log2 интенсивности свеченияА-128-146-16Isp+Isp–Isp+Isp–Рисунок 3.21 — Экспрессия генов FIG1 и FIT2 усилена в клонах Isp+ по сравнению с клонами Isp– . Показаны результаты транскриптомного анализа (А, В) и ОТ-ПЦР-РВ (Б, Г). *** — < 0,001 (модифицированный t-критерий с поправкой Бенджамини-Хохберга); * — < 0,05(критерий Манна-Уитни).Усиление экспрессии генов, продукты которых вовлечены в импорт железа, в клонах Isp+ может приводить к изменению чувствительности таких клоновк недостатку и/или избытку ионов железа в среде.
Чувствительность к избытку железа в среде оценивали на среде SMC со всеми необходимыми добавкамии добавлением 20 мМ FeSO4 . Меньшая концентрация сульфата железа, а также использование сред на основе YEPD или SC не позволяли зарегистрироватьчувствительность штамма (данные не показаны). Для оценки чувствительностиштаммов к недостатку железа использовали хелатор ионов переходных металлов BPS в концентрации 140 мкМ.
При концентрации BPS 130 мкМ и менее103подавление роста не зарегистрировали; при концентрации 150 мкМ и более ненаблюдали роста штаммов (данные не показаны). Мы не обнаружили разницыв чувствительности к недостатку и избытку железа между клонами Isp+ и Isp–(рис. 3.22). Следует отметить, что отсутствие разницы не обусловлено отборомклонов Isp+ в потомстве высеянных на чашку клеток Isp– : при переносе клетоксо среды с BPS на среду без лизина было видно сохранение чёткой разницы пофенотипу (данные не показаны).Isp+Isp–SMCSMC + FeSO4YEPDYEPD + BPSРисунок 3.22 — Клоны Isp+ и Isp– не отличаются по чувствительности к избытку и недостатку железа.
Показаны последовательные пятикратные разведения клонов изолятов p3 и m2;концентрация FeSO4 составила 20 мМ, концентрация BPS — 140 мкМ.Таким образом, в клонах Isp+ активированы гены, контролирующие импорт железа в дрожжевую клетку, однако вопрос о функциональном значениитакой регуляции остаётся открытым в связи с тем, что нам не удалось выявитьфенотипических отличий, которые могли быть связаны с активацией этих генов.3.3.8. В клонах Isp– усилена экспрессия генов хромосом II и IXКак сказано ранее, гены, экспрессия которых активирована в клонах Isp–относительно клонов Isp+ , не объединены в функциональные группы (приложение Г).
Чтобы найти другие причины, которые могут объяснить полученныйсписок генов с изменённой экспрессией, мы разделили гены по их хромосомной локализации и обнаружили, что в клонах Isp– повышена экспрессия геновхромосом II и IX (рис. 3.23).log2 относительной экспрессии104210-1III IIIIVV VIVII VIII IX XXIXIIXIIIXIVXVXVIРисунок 3.23 — В клонах Isp– приблизительно двукратно повышена экспрессия генов, расположенных на хромосомах II и IX. Показан уровень экспрессии генов в клонах изолята Isp–(m2) по отношению к уровню в клонах изолята Isp+ (p2).
Вертикальные пунктирные линии разделяют гены разных хромосом, а горизонтальная пунктирная линия отмечает уровень двукратногоувеличения экспрессии.Эти данные свидетельствуют о том, что использованный изолят Isp– является дисомиком по хромосомам II и IX. Если эта гипотеза верна, можно предположить, что наблюдаемая разница по эффективности нонсенс-супрессии можетбыть связана с изменением дозы генов, находящихся на этих хромосомах. Следует отметить, что при аналогичном сравнении экспрессии генов в зависимостиот их хромосомной локализации в клонах sfp1Δ и Isp+ мы не выявили подобнойзависимости (данные не представлены).1053.4. Сравнительный анализ геномов клонов Isp+ и Isp–3.4.1. Секвенирование геномов подтверждает данные о вариабельнойкопийности хромосом II и IXДля того чтобы проверить данные о разнице в копийности материала хромосом II и IX, мы изучили геномную ДНК одного клона фенотипа Isp+ (p3) иодного клона фенотипа Isp– (m2) с помощью секвенирования.
Для данного эксперимента выбрали именно изолят p3, поскольку он непосредственно происходитот клона m2, что должно обеспечить их максимальное сходство. Выравниваниекоротких прочтений на геном S288C позволило нам обнаружить, что относительное покрытие (плотность коротких прочтений, отнесённая к медианномузначению плотности коротких прочтений по геному) для некоторых хромосомзаметно отличается от единицы (см.
рисунок 3.24). В случае обоих исследованных изолятов (p3 и m2) такую ситуацию наблюдали для хромосомы IX и тольков случае изолята m2 (Isp– ) — для хромосомы II. Поскольку соотношение числакоротких прочтений, соответствующих каждому участку генома, должно бытьпропорционально копийности этого участка в исследуемом геноме, полученныеданные позволяют говорить о повышенной копийности хромосом II и IX в изоляте m2, а также о вероятной смеси клеток с одной и двумя копиями хромосомыIX во взятом для анализа клоне p3.Различная копийность генетического материала хромосомы II в клонах разного фенотипа представляет особый интерес, т. к. именно на этой хромосоме локализованы гены LYS2 и HIS7, количество продуктов которых использовано дляоценки эффективности нонсенс-супрессии в изучаемой системе. Кроме того, наэтой хромосоме также расположен ген SUP45, для мутантной аллели которого,sup45-400, ранее показана связь с проявлением изучаемого фенотипа (Аксеноваи др., 2006), а в данной работе обнаружено различие по уровню продукта междуштаммами Isp+ и Isp– (см.
раздел 3.7.2). В частности, можно предположить, чторазличие по уровню продуктов lys2-87 и his7-1, которое проявляется как различная эффективность роста на средах без лизина или гистидина соответственно,связано с копийностью соответствующих генов.106Относительное покрытиеА210IБОтносительное покрытиеIsp+ (p3)II IIIIVV VIVII VIII IXXXIXIIXIII XIVXVXVIIsp– (m2)3210III IIIIVV VIVII VIII IX X XI XIIXIII XIV XVXVIХромосомаРисунок 3.24 — Плотность картированных коротких прочтений в координатах референсного генома. Показаны результаты анализа выравнивания прочтений геномной ДНК клонов Isp+(А) и Isp– (Б) на геном штамма S288C. Красным цветом отмечены хромосомы с повышеннымпокрытием.3.4.2. Анализ кариотипа независимо полученных клонов Isp+ и Isp–Тем не менее, нельзя исключить, что дупликация хромосомы II характернатолько для конкретного изолята m2 (Isp– ), использованного для анализа транскриптома и секвенирования генома, и либо лежит в основе одного из нескольких способов приобретения фенотипа Isp– , либо вообще не принимает участия вформировании супрессорного фенотипа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
