Диссертация (1145883), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Фенотип Isp+ и его связь с уровнем экспрессии различных геновДля того чтобы разобраться в причинах изменения фенотипа с супрессорного (Isp– ) на несупрессорный (Isp+ ), нужно уточнить причину исходногопоявления фенотипа Isp– . Наши данные подтверждают, что нарушение терминации трансляции в исходном штамме вызвано именно мутацией sup35-25, поскольку внесение SUP35 дикого типа на плазмиде приводит к прекращениюнонсенс-супрессии, т. е. восстанавливает нормальную эффективность терминации трансляции (см. рис.
3.19). Нормальную эффективность терминации такжевосстанавливает сверхэкспрессия мутантной аллели sup35-25 (Radchenko et al.,2011), то есть можно предположить, что повышение уровня мутантного белка Sup35 компенсирует снижение его активности. Необходимо отметить, что вклонах фенотипа Isp+ количество Sup35p приблизительно в 1,5-2 раза увеличе-125но по сравнению с клонами Isp– (Radchenko et al., 2011; Радченко, 2014).
Этирезультаты позволили предположить, что видимая компенсация нарушения терминации трансляции в клонах Isp+ определяется количеством мутантного белкаSup35 (Radchenko et al., 2011; Радченко, 2014). Ранее было показано увеличениеуровня мРНК sup35-25 в клонах Isp+ по сравнению с клонами Isp– (Radchenkoet al., 2011), но причины, вызывающие такое изменение, оставались непонятными. Мы попытались выявить механизм, активирующий экспрессию sup35-25 вклонах Isp+ , а также найти другие возможные регуляторы эффективности нонсенс-супрессии, изменяющие экспрессию. С этой целью мы решили сравнитьуровень экспрессии как можно большего количества генов в клонах Isp+ и Isp– .К сожалению, анализ транскриптома не позволил нам не только разобраться в причинах увеличения экспрессии sup35-25 в клонах Isp+ , но и воспроизвести этот результат: использованный в нашей работе метод не выявил разницыпо уровню мРНК гена SUP35 в клонах Isp+ и Isp– .
Тем не менее, этот анализ далнам множество важных данных (рис. 4.1). Несколько неожиданным, но оченьважным фактом оказалось то, что мы почти не обнаружили известных мишеней Sfp1p среди генов, экспрессия которых различается в клонах Isp+ и Isp– .Следует отметить, что мы действительно обнаружили большое количество мишеней SFP1 среди генов, изменяющих экспрессию при делеции SFP1 (Drozdovaet al., 2014; см. табл. 3.6) — следовательно, проведённый анализ действительнопозволяет оценивать активность Sfp1p.sfp1Δ899 генов1043 гена(обогащены мишеням Sfp1p)258 генов(обогащены генами+Isp хромосом II и IX)74 гена(обогащены мишенямиGcn4p и Aft1p)Isp–Рисунок 4.1 — Основные результаты анализа профилей экспрессии.
Направление стрелкипоказывает направление перехода от предкового изолята к потомку. Над изогнутой вверх частьстрелки указано число и характерные особенности генов, экспрессия которых была повышена при таком переходе, над изогнутой вниз частью стрелки — та же информация для генов сосниженной экспрессией.Клоны Isp+ и Isp– отличаются по экспрессии многих генов, хотя это различие выражено значительно слабее, чем при сравнении любых клонов с интактным геном SFP1 со штаммом с делецией SFP1 (см. табл. 3.6). Тем не менее, нашанализ позволил выявить около 300 генов, которые мы признали изменившимиэкспрессию в клонах Isp+ по сравнению с клонами Isp– ; около четверти из них126характеризуются повышенным уровнем экспрессии в клонах Isp+ , у остальныхуровень экспрессии снижен (см.
прил. В).Большинство генов с повышенной экспрессией в клонах Isp+ являютсямишенями транскрипционных факторов Aft1 и Gcn4. При этом мы не наблюдали изменения экспрессии гена GCN4 и зарегистрировали небольшое увеличение экспрессии AFT1. Тем не менее, известно, что регуляция активностиэтих транскрипционных факторов не ограничена синтезом мРНК: активностьAft1p регулируется в том числе перемещением между ядром и цитоплазмой(Yamaguchi-Iwai et al., 2002; см. Outten, Albetel, 2013), а активность Gcn4p —на уровне синтеза в связи с конкуренцией процессов инициации трансляции основной ORF продукта и коротких ORF в промоторе (см.
раздел 1.2.2). Можнопредположить, что усиление экспрессии генов, контролируемых Gcn4p и Aft1p,может косвенно отражать большую скорость роста клонов Isp+ , однако подтверждений этому предположению у нас нет.Ещё больше вопросов вызывает группа генов, экспрессия которых выше вклонах Isp– . У них нет общих функций, хотя они и объединены регулирующимиих экспрессию транскрипционными факторами (см.
табл. 3.9). Но наиболее очевидное свойство, объединяющее эти гены, — это их хромосомная локализация.Почти все гены с повышенной экспрессией в клонах Isp– (229 из 258) локализованы на хромосомах II или IX (см. рис. 3.23); следует также отметить, чтона хромосоме II расположены гены HIS7 и LYS2, уровень продуктов которых иопределяет изучаемый фенотип.4.2. Связь фенотипа Isp– и кариотипа клонаАнеуплоидия изолята m2 (Isp– ), а точнее его дисомия по хромосомам II иIX, показана различными способами, и все эти методы дали сходный результат.Тем не менее, данные по экспрессии генов и данные полногеномного секвенирования были получены только для одного изолята Isp– , и потому могли свидетельствовать лишь о том, что в процессе культивирования, приведшем к получениюизолята m2, была отобрана относительно устойчивая фенокопия штамма [isp- ], а127дополнительные хромосомы II и IX могли быть или не быть связаны с особенностями фенотипа.
Для того чтобы показать связь кариотипа и фенотипа, мы воспроизвели событие изменения фенотипа, то есть отобрали в потомстве клоновIsp+ клоны Isp– и наоборот (см. рис. 3.25). Для последующего анализа кариотипамы использовали ДНК клонов двух различных фенотипов (Isp+ и Isp– ), однаконаблюдали не менее пяти вариантов кариотипа: эуплоидный, дополнительнаяхромосома II, дополнительные хромосомы II и IX, дополнительная хромосомаIX или дополнительная хромосома XIV (см. рис. 3.25). Поскольку хорошая изученность генома S.
cerevisiae позволяет очертить круг генов, дуплицированныхв каждом случае, для удобства на рис. 4.2 показана хромосомная локализациянекоторых упомянутых в работе генов.IVXIIXVVIIXVIAFT1XIII IIRPS9AXIVsup45-400RPS9Blys2-87TEF2his7-1sup35-25XISFP1VIIIIXVIIмтхade1-14XGCN4ura3IIIleu2-B2thr4-B15MATaVHIS6SIS2Рисунок 4.2 — Хромосомное расположение некоторых генов, упомянутых в работе. Хромосомы упорядочены по длине. Красным цветом выделены хромосомы, дисомию по которымнаблюдали в изученных штаммах.Наиболее важным результатом стала абсолютная корреляция копийностихромосомы II и фенотипа соответствующего клона: все изученные клоны Isp+обладали нормальной копийностью хромосомы II, а все изученные клоны Isp–оказались дисомиками по этой хромосоме (см.
рис. 3.25). Несомненно, корреляция далеко не всегда основана на причинно-следственной взаимосвязи, однакомы наблюдали именно переход от одного фенотипа к другому (появление клонов128одного фенотипа в митотическом потомстве клонов другого фенотипа) и выявили, что этот переход сопровождается специфическим изменением кариотипа.Чем может быть обусловлено изменение фенотипа при появлении дополнительной хромосомы II? Следует отметить, что маркеры нонсенс-супрессии,то есть супрессируемые нонсенс-мутации his7-1 и lys2-87, расположены на этойхромосоме, в то время как ещё одна супрессируемая нонсенс-мутация, ade1-14,расположена на хромосоме I.
В то время как штаммы Isp+ и Isp– различаютсяпо эффективности роста на средах без гистидина и лизина, они не различаютсяпо эффективности роста на среде без аденина (см. рис. 3.2). lys2-87 и ade1-14являются нонсенс-мутациями одного типа (UGA, опал), и эффективность их супрессии в клонах Isp– сходна (рис. 3.2); тем не менее, фактор [ISP+ ] регулируетих различным образом. Это различие можно объяснить показанным нами увеличением дозы гена lys2-87 при неизменной дозе гена ade1-14.Мы показали, что введение дополнительной копии his7-1 действительноприводит к улучшению роста клонов Isp+ на среде без гистидина (рис. 3.32), ипредполагаем, что в регуляции роста на среде без лизина задействован аналогичный механизм.
Тем не менее, дополнительной копии his7-1 оказалось недостаточно для того, чтобы воспроизвести фенотип Isp– . Мы предполагаем, что свойвклад вносят и другие гены хромосомы II; конечно, нельзя также исключить,что случайно отобранная миссенс-мутация во вносимой на плазмиде аллели his7снижает стабильность или активность фермента His7p.Кроме самих генов HIS7 и LYS2, на хромосоме II расположены более 450белок-кодирующих генов, в том числе не менее 7 генов, связанных с трансляцией, и 13 генов тРНК. Ранее показано, что мутация в гене SUP45 необходима дляпроявления фенотипа Isp+ (Аксенова и др., 2006), однако совокупность данных,полученных ранее и в данной работе, позволяет утверждать, что дополнительная копия аллели sup45-400 не определяет супрессорный фенотип клонов Isp– .Зато мы обнаружили аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии TEF2 и геновестественных супрессорных тРНК tQ(UUG)L и tC(GCA)B (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
