Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1145883), страница 25

Файл №1145883 Диссертация (Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae) 25 страницаДиссертация (1145883) страница 252019-06-29СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 25)

Также известно, что in vitro GuHCl приводит к денатурациибелков, однако речь идёт о концентрации около 6 М (см. Chang, 2009), в то время как на три порядка более низкая конечная концентрация этого вещества всреде существенно замедляет рост дрожжевых штаммов (Jung et al., 2002; см.рис. 3.29). Известно, что выращивание дрожжей на среде с GuHCl индуцируетпоявление дыхательно некомпетентных клонов (Juliani et al., 1973); было высказано предположение, что потеря дыхательной компетентности связана с потереймитохондриальной ДНК из-за потери контакта со внутренней мембраной митохондрии (Juliani et al., 1973).

Мы также наблюдали выщепление дыхательнонекомпетентных клонов (см. рис. 3.29), однако этот фенотип, согласно нашимданным, не является причиной изменения эффективности роста на средах безгистидина или лизина (см. рис. 3.31).Ранее на штамме, родственном использованному в данной работе, былопоказано, что клоны Isp– отличаются от клонов Isp+ большим количеством белка Sis2 (Hal3). Эта особенность определяет большую устойчивость клонов Isp–к токсичному действию хлоридов гуанидиния и других катионов, а также увеличивает эффективность нонсенс-супрессии за счёт ингибирования фосфатазыPpz1, фосфорилирующей фактор элонгации трансляции EF1Bα (Аксенова, 2006;Aksenova et al., 2007). Мы подтвердили, что введение центромерной плазмидыс SIS2 в полученный в данной работе изолят Isp+ (p3) действительно приводитк увеличению устойчивости к GuHCl и появлению клонов Lys+ , сохраняющихауксотрофность по гистидину (данные не показаны), поэтому мы можем предполагать, что описанный механизм действует и в использованной системе.

К сожалению, наши данные не позволяют нам выдвинуть новые гипотезы о причинахповышения уровня белка Sis2 в клонах Isp– : SIS2 локализован на хромосоме XI,а изменения уровня мРНК SIS2 или белка Sis2 в дисомиках по хромосомам IIили IX показано не было (Dephoure et al., 2014).134Мы предполагаем, что появление клонов супрессорного фенотипа при выращивании клеток на среде с GuHCl достигается за счёт преимущественноговыживания более устойчивых к этому веществу клеток (рис.

4.3), и по крайнеймере часть таких клеток, как мы показали, приобретает лишнюю хромосому II.В таком случае приобретение способности к росту на средах без лизина илигистидина является побочным эффектом приобретения лишней хромосомы, а ненепосредственным результатом воздействия GuHCl.Isp+, YEPD + GuHClПродолжительнаяинкубацияКлетки Isp– болееустойчивы к GuHCl,поэтому делятся быстрееРисунок 4.3 — Модель, которая может объяснять изменение фенотипа под воздействиемGuHCl. Фиолетовым цветом обозначены клетки Isp+ , а голубым цветом — клетки Isp– .Случайное возникновениеклеток Isp–4.5.

Участие гена SFP1 в изменении фенотипа с Isp– на Isp+Несмотря на то, что механизм обратимого изменения эффективности нонсенс-супрессии, выявленный в нашей работе, отличается от постулированногоранее, наши данные подтверждают показанную ранее связь изменения нонсенссупрессии с геном SFP1, а именно (i) появление клонов Isp+ в потомстве клоновIsp– , переживших сверхэкспрессию SFP1, и (ii) отсутствие полной компенсациинонсенс-супрессии при вводе центромерной плазмиды с SFP1 в штамм с делецией SFP1.Предполагают, что белок Sfp1p — транскрипционный фактор, регулирующий гены биогенеза рибосом и гены рибосомных белков.

Определена последовательность, с которой Sfp1p предпочтительно связывается in vitro (Zhu et al.,2009), однако до сих пор нет единого мнения о том, действительно ли этот белокнепосредственно связывается с ДНК in vivo (см. раздел 1.2.1).По аминокислотному составу Sfp1p похож на прионогенные белки дрожжей, поскольку содержит обогащённые аспарагином и глутамином участки.

По-135тенциальная прионогенность Sfp1p была отмечена во всех наиболее известныхбиоинформатических анализах с использованием разных подходов (Michelitsch,Weissman, 2000; Harrison, Gerstein, 2003; Alberti et al., 2009), однако подробноприонные или амилоидные свойства Sfp1p проверены не были за исключениемданных нашей лаборатории (Rogoza et al., 2010) и того, что мы недавно показали, что при сверхэкспрессии под контролем промотора CUP1 химерный белокSfp1-Cerulean образует агрегаты (Matveenko et al., 2016).Самой простой гипотезой появления клонов Isp+ в потомстве клонов Isp–после временной сверхэкспрессии SFP1 был бы отбор более устойчивых к токсичному действию SFP1 клонов, однако, согласно нашим данным, это не так:для клонов Isp+ сверхэкспрессия SFP1 даже более токсична, чем для клонов Isp–(см.

рис. 3.27).Эти данные заставляют думать, что сверхэкспрессия SFP1 может влиятьна вероятность потери лишней хромосомы при делении клеток. Связь SFP1 склеточным циклом показана ранее: делеция этого гена приводит к уменьшениюразмера клеток и появлению многочисленных почек (Blumberg, Silver, 1991), асверхэкспрессия — к остановке клеточного цикла в фазе G2 (Xu, Norris, 1998).Тем не менее, механизм влияния Sfp1p на потерю лишних хромосом не совсемпонятен в том числе потому, что не совсем понятен и сам механизм потерилишних хромосом. Можно предложить не менее двух возможных вариантов.Во-первых, можно предположить, что Sfp1p влияет на сборку митотического веретена или расхождение хромосом.

В литературе есть данные о том, чтосверхэкспрессия SFP1 приводит к задержке дрожжевых клеток на этапе перехода из стадии G2 в митоз и к увеличению экспрессии гена PDS1, кодирующегобелок секурин, препятствующий разделению гомологичных хромосом и началуанафазы (Xu, Norris, 1998). Можно предположить, что задержка дрожжевых клеток в митозе вызывает активацию проверки корректной сборки митотическоговеретена или, напротив, потерю хромосом из-за его неправильной сборки.Во-вторых, возможно, что сверхэкспрессия SFP1 приводит к более частому появлению двуцепочечных разрывов в ДНК или нарушает их репарацию,что приводит к потере хромосом; следовательно, появляются клетки с уменьшенным числом хромосом; эуплоидные клетки выживают, а клетки с меньшимколичеством хромосом — нет.

Этот сугубо гипотетический механизм хорошо со-136гласуется с данными о меньшей устойчивости клонов Isp+ , чем клонов Isp– , ксверхэкспрессии SFP1, однако не поддержан известными литературными данными.Делеция SFP1 приводит к появлению супрессии his7-1 и lys2-87 в штаммеIsp+ , то есть даёт схожий с Isp– фенотип, причём этот эффект не компенсируетсявведением центромерной плазмиды с SFP1 (Rogoza et al., 2010; см.

рис. 1.12).Эти результаты сходны с изгнанием приона при временной инактивации егоструктурного гена, однако это объяснение не является единственным.Isp+ДелецияSFP1sfp1Δhis7-1???lys2-87 SFP1IIXIIAde+His+Lys+?Isp–↑↑ SFP1his7-1lys2-87SFP1IIXIIAde+His–Lys–his7-1lys2-87SFP1II IIXIIAde+His+Lys+Рисунок 4.4 — События, которые могут происходить при делеции или сверхэкспрессииSFP1. Голубой цвет соответствует супрессорному фенотипу (Ade+ His+ Lys+ ) Isp+ , фиолетовый —несупрессорному (Ade+ His– Lys– ).

Номера обозначают соответствующие хромосомы.Следует отметить, что делеция SFP1 приводит к нонсенс-супрессии нетолько в штамме 25-25-2В-П3982, но и в штамме 1Б-Д1606, не содержащемсупрессорных мутаций и лишь отдалённо родственном исследуемому штамму(Радченко, 2014). Тем не менее, опосредованная делецией SFP1 нонсенс-супрессия в производном штамма 1Б-Д1606 сходным образом не полностью компенсируется введением центромерной плазмиды с SFP1 (см. рис. 3.28).

Можнопредположить, что делеция SFP1 или длительное культивирование штаммовбез SFP1 сопровождается отбором дополнительных мутаций, увеличивающихжизнеспособность таких штаммов (рис. 4.4). В обоих штаммах увеличение эффективности нонсенс-супрессии сопровождается снижением экспрессии геновSUP35 и SUP45 (Radchenko et al., 2011; Радченко, 2014). Эти данные согласуются с имеющейся в литературе информацией о снижении уровня транскриптовSUP35 и SUP45 в штамме с делецией SFP1 на основе W303 (Jorgensen et al.,2002), однако интересно, что при анализе уровня нонсенс-супрессии в коллек-137ции штаммов с делецией не жизненно важных генов дрожжей на основе почти идентичного S288C штамма BY4742 SFP1 выявлен не был (Samanfar et al.,2014).Наиболее очевидное следствие инактивации SFP1 — снижение экспрессиигенов двух групп: генов биогенеза рибосом (Ribi) и генов рибосомных белков (RP), а также генов SUP35 и SUP45 (Jorgensen et al., 2002; см.

раздел 1.2.1). Регуляция экспрессии генов факторов терминации трансляции игенов Ribi, по всей видимости, сходна: как показывает анализ с помощьюSPELL (http://spell.yeastgenome.org/search/show_results?search_string=YBR143C;http://spell.yeastgenome.org/search/show_results?search_string=YDR172W; Hibbs etal., 2007), изменение экспрессии как SUP35, так и SUP45 наиболее сходно стаковым для различных генов биогенеза рибосом.Наши данные об изменении экспрессии генов при делеции SFP1 хорошосогласуются с литературными: мы также наблюдали снижение экспрессии генов RP и Ribi (см. табл.

3.7) и обогащённость промоторов генов с изменённойэкспрессией предполагаемыми сайтами связывания Sfp1p (см. табл. 3.6), однакоизменение экспрессии в клонах Isp– не было связано с изменением регуляциибиогенеза рибосом, несмотря на некоторое сходство фенотипов Isp– и sfp1Δ (см.выше). Интересно, что сходный фенотип некоторых анеуплоидных штаммов иштамма с делецией SFP1, обусловленный, однако, разными процессами, отмеченранее (Thorburn et al., 2013).Уровень экспрессии только одного из генов RP, RPS9A, различается в клонах Isp+ и Isp– (см. табл. 3.7, рис. 3.13 и 3.15), но мы не обнаружили связи междуRPS9A и эффективностью нонсенс-супрессии (см.

рис. 3.18). Следует отметить,что ген RPS9B, паралог RPS9A, локализован на хромосоме II, дуплицированной вклонах Isp– . Можно предположить, что увеличение копийности RPS9B приводитк наблюдаемой нами репрессии RPS9A. С этим предположением очень хорошосогласуются данные Dephoure et al., 2014: экспрессия гена RPS9A в штамме,содержащем дополнительную хромосому II, снижена приблизительно в 5,5–13раз в зависимости от условий выращивания. Можно даже предположить, что репрессия RPS9A опосредована увеличением количества интрона RPS9B, поскольку такая регуляторная петля для паралогичных генов RPS9 уже показана (Plocik,Guthrie, 2012). Следует тем не менее отметить, что мы, в отличие от Dephoure138et al., 2014, не наблюдали изменения экспрессии RPS9B (Drozdova et al., 2014;см.

Характеристики

Список файлов диссертации

Анеуплоидия как механизм обратимого изменения супрессорного фенотипа (ISP) у дрожжей saccharomyces cerevisiae
Свежие статьи
Популярно сейчас
Зачем заказывать выполнение своего задания, если оно уже было выполнено много много раз? Его можно просто купить или даже скачать бесплатно на СтудИзбе. Найдите нужный учебный материал у нас!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6417
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее